A rastre�el

O objetivo geral do seguinte experimento é identificar a toxicidade mitocondrial ou os efeitos benéficos de fármacos utilizando o organismo modelo C. elegans. Isso é alcançado pela quantificação in vivo dos níveis de ATP em linhagens transgênicas de C. elegans que expressam a enzima luciferase de vagalume fundida à proteína fluorescente verde.

O gene de fusão confere duas propriedades distintas aos nematodos. A primeira é que, quando fornecido o substrato Luciferina, os nematodos emitem luz na faixa visível em proporção às suas reservas celulares de ATP. E a segunda é que, quando iluminados com o comprimento de onda apropriado, eles exibirão forte fluorescência verde.

A fluorescência é independente dos níveis de TP nos nematoides e é proporcional à sua massa ou número. Portanto, pode ser utilizada para normalizar as medidas de bioluminescência. Durante um ensaio típico, uma população de vermes desenvolvimentalmente sincronizados é cultivada até o estágio larval L4.

Os nematodos são então tratados com os compostos medicamentosos em teste por um determinado período antes da medição da fluorescência e da bioluminescência. Os resultados indicam potencial toxicidade medicamentosa. Quando a bioluminescência é reduzida, um sinal aumentado indica um acerto para testes adicionais quanto a efeitos benéficos na função mitocondrial.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como triagem de fármacos em células cultivadas, é que a triagem é realizada no contexto fisiológico de um organismo multicelular vivo inteiro, com cerca de 50% de genética compartilhada com os humanos. E, como nos humanos, o organismo requer fosforilação oxidativa mitocondrial para se desenvolver até a fase adulta, e suas mitocôndrias também compartilham com as mitocôndrias de mamíferos muitas características em termos de estrutura, função e bioenergética. Parâmetros críticos dentro do protocolo incluem o estágio de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição do nematódeo ao fármaco de interesse, o semeamento de um número semelhante de nematódeos em cada poço e, naturalmente, a prevenção de contaminação. No dia um, sob condições estéreis, transfira nematódeos de uma placa de meio de crescimento para nematódeos de seis centímetros, em dois mililitros de meio S completo, para um frasco contendo 30 gramas por litro de E. coli.

OP 50 em meio S completo, então incubar o frasco com agitação no quarto dia, branquear o cultivo de nematoides GR para colher os ovos e sincronizar a população de vermes. Em seguida, incubar os ovos durante a noite em um frasco de vidro contendo 15 mililitros de meio S completo com agitação; no dia seguinte, dia cinco, os nematoides estarão no mesmo estágio de crescimento. Para determinar o número de vermes eclodidos, utilizando uma ponteira limpa cada vez, transferir três alíquotas de 100 microlitros de nematoides para tubos microcentrífugos separados contendo 900 microlitros de meio, suplementado com 0,01% de tween 20, pipetando para cima e para baixo algumas vezes para liberar quaisquer vermes aderidos à ponteira.

Em seguida, conte os nematoides em quatro gotas separadas de 10 microlitros de cada um dos tubos de diluição em triplicata e calcule o volume da suspensão de nematoides necessário para preparar dois cultivos de 20 mililitros com 10 nematoides por 10 microlitros; decante volumes aproximados em dois tubos cónicos de 15 mililitros previamente pesados. Pese os tubos para determinar o volume exato dispensado. Em seguida, para ajustar os volumes-alvo, agite suavemente em vórtex e remova o excesso de volume.

Agora, lave os nematódeos com um volume total de 14 mililitros de meio S completo fresco por tubo e re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio S completo com 30 gramas por litro de OP 50. Transfira os nematódeos para frascos cónicos de vidro contendo 15 mililitros de meio S completo com 30 gramas por litro de OP 50.

Complete com OP 50 até um volume total de 20 mililitros por frasco e registre o horário da alimentação. Calcule a média do número de nematoides em nove gotas de 10 microlitros para confirmar que os cultivos foram diluídos a 10 nematoides por 10 microlitros. Coloque os cultivos no incubador por 42 a 44 horas.

No sétimo dia, transfira as culturas de nematoides para um único frasco com agitação suave contínua. Em seguida, transfira três alíquotas de quatro mililitros de nematoides para um único recipiente estéril de 60 mililitros. Utilize uma pipeta de oito canais para distribuir, em um poço de 96, 25 microlitros de nematoides em suspensão por poço.

Placas microtituladoras pretas com fundos planos e transparentes. Em seguida, recoloque as tampas nas placas e reserve-as. Cada vez que duas placas tiverem sido semeadas, transfira outros dois alíquotas de 2,5 mililitros de nematoides para o recipiente, a fim de repor o volume perdido.

Após semear 13 a 14 placas com nematodos, adicione 74 microlitros de meio completo S a cada poço e transfira as placas para uma câmara úmida e para um incubador com agitação até a administração do fármaco, enquanto as placas estão sob agitação. Descongele 2 placas de solda de 96 poços contendo fármacos para teste. Em seguida, utilizando uma pipeta multicanal e trocando as ponteiras a cada vez.

Transfira um microlitro da primeira coluna da primeira placa de fármaco para as colunas um a cinco de uma placa de nematódeos. Transfira outro microlitro da segunda coluna da placa de fármaco para as colunas oito a 12 da placa de nematódeos. Em seguida, adicione um microlitro de veículo às colunas seis e sete da placa de nematódeos.

Utilize as colunas restantes na placa de fármacos para tratar o restante das placas de nematódeos da mesma maneira, certificando-se de incluir também duas placas tratadas apenas com veículo. Em seguida, devolva todas as placas às câmaras úmidas no incubador com agitação por mais 20 a 22 horas no oitavo dia. Para preparar uma placa controle de fundo para leituras de fluorescência, combine o conteúdo dos poços de uma placa de nematódeos tratada apenas com veículo e deixe os nematódeos sedimentarem por dois a três minutos.

Em seguida, colete as bactérias contendo snat e carregue amostras de 100 microlitros em cada poço de uma microplaca preta com fundo transparente. Observe a placa ao microscópio, anotando os poços nos quais os nematoides podem ser vistos, para permitir a exclusão desses poços da estimativa de fundo fluorescente. Em seguida, leia a fluorescência finalmente para medir a bioluminescência de cada placa.

Em seguida, distribua 50 microlitros de tampão de luminescência recém-preparado para cada poço, coloque a placa em uma plataforma agitadora e inicie o cronômetro após três minutos. Leia a luminescência a uma taxa de um segundo por medição. Neste primeiro experimento representativo, rot, um inibidor do complexo mitocondrial um, reduziu a emissão de luz pelos nematoides após exposições tanto curtas quanto mais longas, em uma faixa de concentrações.

Neste experimento, demonstrou-se que o herbicida paraquat reduz significativamente a fluorescência da GFP e a bioluminescência normalizada da linhagem C PE 2 54. Além disso, a diminuição da bioluminescência foi maior do que a da fluorescência, o que está de acordo com os efeitos conhecidos de diminuição da função mitocondrial e redução da produção de ATP induzidos pela droga. Este gráfico ilustra um exemplo de um composto que potencializa a bioluminescência do nematodo, o intermediário do ciclo ácido cítrico oxaloacetato, em uma única concentração de oito milimolares.

Observe que a variabilidade experimental observada entre essas execuções replicadas não é incomum em experimentos baseados em Lucifer. Aqui, compostos inibidores da luciferase de Firefly foram observados afetar a atividade de luciferases in vitro em 25 micromolar e 100 micromolar, com uma atenuação quase completa da atividade pelo composto DDD. 1, 4 3 4, embora não diretamente comparável, uma diminuição significativa na bioluminescência foi observada após o tratamento com compostos inibidores de Lucifer também in vivo.

Demonstrando que as alterações na bioluminescência podem resultar da ação de inibidores da enzima luciferase ao invés de mudanças nos níveis in vivo de ATP. Ao realizar este procedimento, é importante considerar que compostos podem afetar diretamente a atividade da enzima luciferase de vagalume, ao invés de afetar o estado energético do verme. Assim, as alterações podem ser validadas utilizando diversas técnicas para avaliação da função mitocondrial, como, por exemplo, a determinação do consumo de oxigênio, a determinação do potencial da membrana mitocondrial, a detecção de espécies reativas de oxigênio ou a visualização das mitocôndrias em linhagens de C. elegans.

Com marcação GFP, mitocôndrias.