実装化学反応ネットワーク用プラスミド由来のDNA鎖置換ゲイツ

この手順の全体的な目標は、細菌プラスミドからDNA鎖置換ゲートを導出することです。この技術の主な利点は、細菌プラスミドを高純度の供給源として利用し、堅牢なDNAゲートを生成することです。この手順を実証するのは、同僚のSam Dipと私自身です 大量生産を開始し、付属のテキストプロトコルに記載されているDNA分離キットを使用して、ellucianに続く製造元の指示に従って、DNAゲートを含むDNAゲートを分離します。

標準的な手法を用いてプラスミドDNAの濃度を測定します。次に、プラスミドの各ミリグラムに対して4ユニットの制限酵素PV U2 HFを添加してDNAを消化します。次に、2つの等量の氷冷無水エタノールをサンプルに加えます。

混合物をマイナス80°Cで少なくとも1時間インキュベートして、DNAを沈殿させます。次に、サンプルを10, 000〜14, 000倍Gおよび摂氏0度で30分間遠心分離することにより、沈殿したDNAをペレット化します。SNATを取り外し、サンプルに室温95%エタノール1000マイクロリットルを追加します。

次に、サンプルを10〜15倍反転させ、サンプルを10,000〜14,000倍Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。終了したら、上清を取り除き、ベンチでDNAを10〜20分間風乾します。沈殿したDNAから上清を除去する際は、ペレットを乱さないように注意してください。

乾燥したら、DNAペレットを最大200マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に懸濁し、ボルテックスで混合します。200マイクロリットル以上の水を追加すると、通常、サンプルは希釈されて使用されます。動力学実験では、製造元の指示に従って、分光光度計を使用して再懸濁したDNAを測定します。

次に、プラスミド1マイクログラムにつき1つずつ、ニッキング酵素M-B-B-S-R-Dを4ユニット追加し、対応する酵素バッファーを追加します。サンプルを摂氏65度で1時間インキュベートし、ジョイントゲートを分解します。次に、プラスミド1マイクログラムあたり1ユニットのニッキング酵素NT BST mbと対応する酵素バッファーを8ユニット追加して、フォークゲートを消化します。

サンプルを摂氏55度で1時間インキュベートします。蛍光レポーターを最初に調製するには、付属のテキストプロトコルに記載されているようにサンプルを懸濁して定量します。次に、レポーターのボトムストランド10マイクロリットルとトップクエンチャーストランド13マイクロリットルをトリスアセテートEDTAバッファーに12.5ミリモルのマグネシウムで混合します。

すべての植物相、4つのラベル付きストランドが急冷されることを確実にするには、クエンチャーラベルストランドの30%過剰を追加する必要があります。次に、サーマルサイクラーを使用してレポーターC複合体をアニします。サンプルを摂氏95度から摂氏20度まで、1分間に摂氏1度の速度で冷却します。

終了したら、キャリブレーション後、サンプルを摂氏4度で保存しました。蛍光測定を開始するには、まず温度コントローラーを25°Cに設定し、温度が安定します。データ集録ソフトウェアで動力学測定の適切なパラメータを設定します。

スペクトル蛍光計のソフトウェアを開いた後、励起モノクロと発光モノクロの両方でスリップ幅を2.73ナノメートルに設定します。次に、62番目の時点ごとに積分時間を10秒に設定し、合計測定時間を24時間に設定します。最後に、励起波長と発光波長を、実験で使用した植物相の森林と一致するように設定します。

次に、410.2マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水と52.8マイクロリットルの125ミリモルのマグネシウムを含む10個のエクストラアセテートEDTAバッファーを合成石英セルに加えます。また、2マイクロリットルの300ミリモルポリTストランドを追加し、合成石英セルを10〜15秒間ボルテックスします。次に、10マイクロモルのレポーターストランドの9マイクロリットルと10マイクロモルの各補助ストランドの6マイクロリットル

次に、ジョイントゲートとフォークゲートの両方の45マイクロリットルを1マイクロモルで、溶液を少なくとも20回上下にピペッティングして穏やかに混合します。最後に、9マイクロリットルの10%ナトリウムで、0.15%SDSの最終濃度を達成するために、少なくとも20回ピペッティングして反応を穏やかに混合し、すぐに合成クォート細胞をスペクトルフレーターのチャンバーに入れ、速度論測定を開始します。5分間の測定後、入力ストランドを3マイクロリットル追加します。

合成クォートセルに10マイクロモルを追加します。データ取得プログラムを一時停止している間に、反応をピペッティングで少なくとも20回上下させて反応を穏やかに混合し、ライトカバーを閉じて反応速度が安定するまで記録を続けます。ここでは、プラズマ由来ゲートと合成ゲートの状態速度論データを実験で示しています。

シグナル鎖Aの濃度は固定されていますが、触媒シグナルBの量は変化します。シグナルCは、反応の進行を中断せずに読み出すために使用されます。触媒サイクルのターンオーバーは、特定の時間に各触媒Bに対して生成されるシグナルCの量として定義されます。

理想的な触媒システムの場合、この回転数は時間とともに直線的に増加し、基質が制限されない限り、触媒の量とは無関係である必要があります。ここでは、合成された系がプラズマ由来の系よりもはるかに早く理想的な回転率の線形増加から逸脱していることが観察され、望ましくない副反応による触媒の隔離を示しています。ここでは、プラズマ由来ゲートと合成ゲートの回路リークを比較し、プラズマ由来ゲートを用いたリークシグナルの割合は、反応後10時間後に合成ゲートを用いたリークシグナルの割合が合成ゲートを用いた場合に比べて約8%少ないことが観察されます。

このビデオを見れば、細菌プラスミドから頑健なDNAゲートを作製する方法と、蛍光速度論測定を使用してゲートをテストする方法について十分に理解できるはずです。