Name: 정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 정량 실시간 PCR을 사용하여 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이를 평가하는 방법을. 종양 특이적 mRNA를 검출하여 전이 수준을 정량적으로 분석하는 이 기술은 암 연구에 필수적인 도구입니다.

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예치 연구소는 미국 암 학회 기관 연구 그랜트 (IRG-97-219-14) 국방부의 교부로부터 연구 자금으로, MUSC에서 홀 링스 암 센터 수여 (W81XWH-11-2-에서 연구 자금 지원됩니다 0229) MUSC에서, 그리고 우려 (ESY에) 재단의 수상으로.

이 프로토콜은 가이드 라인과 사우스 캐롤라이나 (MUSC)과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 동물 보호 기준을 따른다. 1. 폐 해부 <ol><li> 유방 종양 절제술 (선택 연구 목표 및 기본 종양 분석 또는 꼬리 정맥 주입이 수행 여부에 따라). <ol><li> IACUC 대학 규정에 따라 이소 플루 란 마취의 치사량을 사용하여 마우스를 안락사. 수술 전위에 의해 euthanization을 확인합니다. </li><li> 폼 보드, 사지 확산의 뒷면에 마우스를 배치하여 해부 핀과 핀. </li><li> 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여, 중심에서 동물의 하부를 파악. </li><li> 가위를 사용하여, 마우스의 복강을 관통하지 않도록주의, 피부를 통해 목으로 상승 했네요. </li><li> 종양 조직을 나타 내기 위해 사지에 피부를 다시 잘라. </li><li> 종양 조직과 홍보를 해부하다추가 분석을 위해 (안이 프로토콜에 자세히 설명) 등의 동결 또는 고정으로, 선호하는 방법으로 eserve. </li></ol></li><li> 폐 조직의 해부. <ol><li> 전술 한 바와 같이, 종양 조직을 수확하는 경우, 과잉의 피부 아래에 핀. </li><li> 집게를 사용하여, 동물의 하단부를 잡고 복막 목의 기부를 향해 위쪽으로 절단 시작한다. </li><li> 조심스럽게 흉강에 출혈 수있는 혈관을 절단되지 않도록주의하면서 흉곽의 왼쪽과 오른쪽 측면을 따라 잘라. 왼쪽과 오른쪽 흉곽의 횡격막과 상부를 절단하여 리브 뼈를 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 마우스의기도를 잡고 앞으로 잡아 당깁니다. </li><li> 해부 가위로 기관을 절단 및 마우스에서 폐를 제거합니다. 참고 : 핵심은 폐에 부착 남아있을 수 있습니다. 이 경우, 신중하게 다섯 로브를 수집주의하면서 폐에서 멀리 마음을 해부하다 (그림 1 참조 </stroNG&gt;). </li><li> 여분의 혈액을 제거하는 PBS로 부드럽게 씻는다. </li></ol></li><li> 폐 조직의 총 평가. <ol><li> 옵션 1 : 생체 내 이미징. <ol><li> 루시 페라 이미징 ~ 10 분 전에 이미지로, 동물에게 복강 내 (IP) 주사 루시페린의 150 ㎎ / ㎏ 용량을 제공합니다. 마취 된 동물 또는 절개 (그림 2) 5 후 제거시 생체 내에서 이미지 폐. </li></ol></li><li> 옵션 2 : 총 평가. <ol><li> 종양 결절을 시각화 스테레오 현미경으로 폐를 검사합니다. 주 : 세포 표지 GFP 경우 GFP를 검출 (510분의 470 nm의 근처 예) 적절한 여기 / 발광 최대치와 광 큐브를 함유 형광 가능한 실체 처리에 앞서 형광 대해 입체적 폐를 조사하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 폐 즉시 분석 할 경우, &#39;RNA 분리&#39;부분을 진행합니다. 그렇지 않으면, 액체 비누를 사용하여 동결 조직 스냅ID 질소 나 드라이 아이스. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. RNA 분리 참고 : 대표 분석을 위해, RNA는 RNA 분리 키트 (자료 목록을 참조)를 사용하여 분리 하였다. 현재의 분석은 하나의 특정 제조 업체의 제품을 사용하는 동안, 분리 키트의 다양한 여러 유명 업체에서 사용할 수 있습니다. 또한, 비 기반 키트 원심 분리 방법이 또한 옵션이다. cDNA를 또한 표준 곡선 분석을위한 세포주 또는 플라스미드로, 양성 대조군 샘플로부터 RNA를 제조한다. 또한, 프라이머 프로브 세트에 대한 특정 양의 제어가 구입하실 수 있습니다 (자료 목록 참조). <ol><li> 이전에 냉동 조직을 사용하는 경우, 드라이 아이스에 냉동 조직을 수집합니다. </li><li> 같은 다음 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화 : 박격포와 유 봉 액체 질소에 조직을 동결 한 후 드라이 아이스를 통해 손에 의해 수행 연삭; 조직 균질 또는 기계적 분리 장치제조업체의 제안에 따라; 초음파, 또는 다른 선호하는 방법. 참고 : 대표 분석을 위해, 균질화 선호하는 방법은 초음파이다. <ol><li> 도 3에 제시된 분석의 비율로 용해 (RNA 분리 키트로 제공) 버퍼 및 2- 메르 캅토 에탄올을 제조 20 ㎕의 2- 머 캅토 에탄올 용해 버퍼마다 1 ml의 용. 재현 탁 조직 300 ㎕의 용해 완충액 30 % 진폭으로 설정 초음파기 10 초 동안 초음파 처리하고 조직의 각 30g을 위해 2- 머 캅토 에탄올이 보충. </li><li> 분쇄 한 후 300 μL 용해 버퍼에 재현 탁 지상 조직, 박격포와 유 봉을 사용하는 경우. </li></ol></li><li> 590 μL TE 버퍼 (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 10 μL의 단백질 분해 효소 K를 추가합니다. 조직의 (즉, 매 30 mg을 위해) 각 300 μL에 600 μL의 단백질 분해 효소 K 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 품어. 참고 : 소화 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> ≥1 원심 분리기 샘플10 분 3,000 g의 이물질을 제거합니다. </li><li> 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> RNA를 침전 상층 액의 모든 900 μL, 450 μL 에탄올 (96 % -100 %)를 추가합니다. </li><li> 컬럼에 해물 / 에탄올 혼합 700 μl를 전송합니다. </li><li> 1 분 ≥13,000 G에서 원심 분리기 샘플은 열에 RNA를 결합합니다. </li><li> 액체 폐기물을 버리고 컬럼에 남아있는 상층 액을 추가하고 다시 스핀. </li><li> 모든 해물이 칼럼을 통해 방사되면 30 초 동안 ≥13,000 g에서 원심 분리 컬럼 샘플의 상부에 세척 완충제 (1)의 350 μL를 추가한다. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 내가 10 배의 DNase의 5 μL 및 샘플 당 DNase를 /의 RNase없는 물 40 μL (50 μL / 샘플의 총 부피)와 효소의 DNase의 5 단위를 혼합하여 DNase의를 준비합니다. </li><li> DNase의 50 μL 각 열을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 품어 추가합니다. </li><li> 열 및 원심 분리기 샘 워시 버퍼 1의 350 μl를 추가PLES 30 초 동안 ≥13,000 G에서. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> 컬럼에 워시 버퍼 2의 600 μl를 추가하고 ≥13,000 g에서 30 초 스핀. </li><li> 열에서 액체를 취소하고 상부를 교체합니다. </li><li> ≥13,000 g에서 2 분 동안 250 워시 버퍼 2 μL와 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 새 컬렉션 튜브에 열의 일부를 넣고 오래 수집 튜브를 폐기합니다. </li><li> 컬럼의 RNase / DNase를 무료로 물을 50 ~ 100 μl를 추가하고 1 분 동안 품어. </li><li> ≥13,000 g에서 1 분간 스핀. </li><li> 다시 실행 RNA 수율을 높이기 위해 칼럼을 통해 수집 된 용출액을. </li><li> 즉시 사용, 얼음에 샘플을 유지하고 정량를 진행합니다. 나중에 사용하기 위해, 드라이 아이스, 액체 질소에 동결 스냅. -80 ° C의 냉동고에서 보관이 필요할 때까지. </li></ol> 3. 첫 번째 가닥 합성 주 : 대표적인 분석을 위해, 역전사 효소 (RT) 반응을 수행 하였다 F(자료 목록 참조) QRT-PCR을 위해 설계 IRST 가닥 cDNA 합성 키트. <ol><li> 샘플은 이전에 수집 된 경우, 얼음에 튜브를 해동. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정한다. </li><li> 전체 RNA의 0.5 μg의 사용, cDNA의 주식을 생성하는 역전사 효소를 사용하여 첫 번째 가닥 합성을 수행합니다. <ol><li> 멸균 된 RNase / DNase의 프리 PCR 튜브 / 플레이트에서, 반응 혼합물 (표 1)을 제조 하였다. 부드럽게 원심 분리기 섞는다. 표준 PCR 기계 (표 2) 프로그램. </li></ol></li><li> 멸균 뉴 클레아없는 물을 사용하여 원하는 볼륨 (일반적으로 50 ~ 100 μL)에 완성 된 반응을 희석. </li></ol> 4. 실시간 PCR 주 : 대표적인 분석을 위해, SYBR 그린을 이용 하였다. 그러나, 임의의 바람직한 방법은 사용자의 결정에 치환 될 수있다. <ol><li> 양성 대조군의 cDNA를 사용하여 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정합니다. <ol><li> 분석 내가 보여 위해N 그림 3은, 양성 대조군의 cDNA를 추천 제조업체를 사용하여 인간의 HER2에 대한 표준 곡선을 준비 (자료 목록 참조). 마우스 GAPDH에 대해, 표준 곡선을 생성하는 음성 대조군 폐의 cDNA를 사용한다. 5 기준을 생성하는 4 : 각 프로브에 대해, 직렬의 cDNA 1 희석. </li></ol></li><li> 표준 곡선 및 실험 샘플을 포함해야 총 샘플들의 수를 계산한다. 참고 : 분석은 여기에 설명 된 내용은 샘플 당 2-3 실험 복제를 분석 하였다. 표준 곡선 분석은 최종 정규화 양을 계산하는 샘플 당 상대적 HER2의 양 및 GAPDH를 결정하도록 적용될 수있는 단순 회귀 분석 모델을 생성하기 위해 수행 하였다. 이 분석은 또한 프라이머 효율이 손의 분석에 적합한 지 확인합니다. </li><li> 멸균 된 RNase / DNase의 무료 관에서, 마스터 믹스 (표 3)를 준비합니다. <ol><li> 마스터 믹스 amoun을 계산샘플 당 T. 하나 이상의 샘플까지 확장 할 수 있습니다. 관심있는 각각의 실험 유전자뿐만 아니라, GAPDH 등의 내부 제어를 위해 마스터 믹스를 사용한다. 200 nm의 최종 농도 GAPDH에 대한 프라이머를 사용합니다. 참고 : 인간 및 마우스 세포의 기원을 구별 할 때 내부 통제에 특히 유용하다. 주 : HER2 프라이머 농도는 최적화 제조업체에 의해 결정 하였다. </li></ol></li><li> 각 표준 또는 실험 샘플에 해당하는 1 μL의 cDNA를을 포함하는 테스트 판을 준비합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 적어도 1의 cDNA 샘플 /을 할당합니다. 각각의 프라이머 프로브 잘 당 마스터 믹스 19 μl를 추가합니다. 참고 :도 3의 대표 데이터를 들어, cDNA를 시료는 각 프라이머 프로브 이중으로 분석하고, 두 개의 샘플의 평균으로 그래프. </li><li> QRT-PCR 시스템에서 실행 반응은 권장 또는 이전 PCR 프로토콜을 테스트하여. 표 4 참조 </s도 3 및도 4에 대표 데이터에 사용되는 PCR 프로토콜 trong&gt;. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

ESY 및 MAA는 FirstString 리서치에 고용되지 않고 회사의 금융이자를 보유하지 않습니다. FirstString 리서치는이 논문에서 제시 한 루시 페라 영상 데이터를 제공했다. GSG는 FirstString 연구의 사장 겸 CEO이다. CLG는 FirstString 연구의 직원입니다. GSG와 CLG는 FirstString 연구가 발행 한 스톡 옵션이 있습니다.

이 프로토콜은 이종 이식 된 마우스 모델을 이용하여 폐에 유방 종양 세포 전이를 평가 QRT-PCR의 용도를 설명한다. 그것은 생물 발광 영상을 포함한 다른 기술, 사용할 수 있으며, 또한 자신의 가치와 한계에도 불구하고 전이를 검출하는 효과가 있음을 인정한다. 제시된 데이터는 QRT-PCR 총 전이 정량 폐 조직 내 종양 유래의 mRNA를 검출하는 효과적인 조치를 제공하는 것이 제안한다. 그것은 QRT-PCR 분석을 보완 또는 이들 이미징 기법 대신에 수행 될 보조 방법을 제공하는 것이 제안된다. 이 기술은 최고의 장비 또는 전이성 부담의 특정 관심사를 가진 연구 그룹에 대한 특정 유형의 제한 액세스 할 수있는 연구 환경에 적합하지만, 역학적 연구를 자세히 설명하지 될 수 있습니다. 유익한 있지만, 여기에 설명 된 QRT-PCR 분석은 한계가있다. 이는 하류의 추가 수행하는 것이 가능하지 않다면역 조직 화학 (IHC) 또는 폐 조직의 전체 RNA를 분리를 위해 사용되기 때문...

QRT-PCR 분석은 종양 전이를 평가하는 방법으로서 제안되어있다. 이 방법은 전이를 평가 관련되지만, 생체 내 이미징 장치 또는 형광 할 입체경 특정 장비에 액세스 할 수없는 사용자를위한 대안으로 제시된다. 일반적으로 사용되는 방법의 논의는 QRT-PCR 분석은 별개로 또는 전이를 평가하는 방법에 동반하여 사용할 수있는 방법에 대한 데모 뒤에 제공된다. 이 절차는 전이성 부담의 정량 분석​​을 제공하는 잠재력을 가지고있다. 실체 현미경하에 폐의 시각화뿐만 아니라 헤 마톡 실린 및 에오신 다음 직렬 절편을 포함하여 총 분석의 표준 방법은 폐 조직의 (H &amp; E) 염색, 정량화하지만 2-5 계산을위한 사용자 정의 된 매개 변수에 크게 의존하고있다. 실체 현미경을 사용하여 전체 폐를 평가할 때, 단지 큰 표면 전이는 VISI은BLE 및 분석은 전이성 병변을 구성하는 것을 결정하기 위해 폐 해부학 적 구조의 합리적인 지식을 가지고 조사를 필요로한다. 이러한 GFP 적절한 여기 / 방출 최대 (GFP 예 : 근처 510분의 470 ㎚)와 빛 큐브를 포함하는 입체 현미경의 사용과 같은 마커로 종양 세포의 형광 라벨은이 과정에서 지원,하지만 표면의 종양 결절은 탐지 가능 . 또한, GFP와 같은 매개 변수 아래에 표시되는 혈액의 오염에서 형광이 가능 전이성 병변의 거짓 식별 될 수 있습니다. 폐 전이를 시각화하기 위해 H &amp; E 염색 한 다음 폐의 단면은 미세 전이와 면역 세포의 침윤을 포함한 다른 마이크로 프로세스를 평가하는 유용한 방법이지만 종종 파라핀 삽입, 절편 및 염색 절차는 전체 폐 조직의 사용을 필요로한다. 따라서, 다운 스트림 절차는이 운전 방식 다음과 같은 이상 없습니다디. 정량화하지만,이 과정은 분석이 폐의 전체 3 차원 구조를 차지하도록 동물 당 염색 폐 구간의 다수를 평가하는 조사원을 필요로한다. 결과적으로, 시험이 유형의 에러를 카운트로 이어질 수 있고, 시간 소모적이며, 분석은 연구자의 판단에 크게 의존한다. (MRI는 PET, SPECT는 예) 현재 수행하거나 실험 쥐 모델 8 생물학적 과정을 테스트하는 데 사용되는 생체 내 이미징 기술의 몇 가지. 생체 내 생물 발광 영상은 전이 (9)의 총보기를 취득하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 일반적으로 인해 종양 세포 주입 후 유선 및 자발적 전이시 폐 같은 특정의 장기에 상주하는 루시퍼 라제 반응 요소를 포함하도록 설계되는 종양 세포의 축적에 루시페라아제 리포터 활성의 존재를 평가하기 위해인가 1루시페라아제 리포터 활성의 0. 시각화는 루시페린 기판 (D-루시페린)의 존재에 의해 유도된다. 루시 페라 제는 생물 발광을 생성 oxyluciferin하는 D-루시페린의 산화 적 탈을 촉매. 정보 있지만,이 방법은 기판의 안정성 (즉, 짧은 반감기)이 실험 동물에 전달되는 방법에 따라 달라집니다 기판의 적절한 분배, 및 탐지 (9)의 낮은 감도 등 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다. 이 기술에 주요 장점은, 비 침습적 인 살아있는 동물에서 수행 될 수 있고, 일반적으로 절개 9,10- 수확되지 않았을 수있는 다수의 기관에서 종양 세포의 전이의 검출을 초래할 수 있다는 것이다. 생체 영상 기술의 일 측면은 양성 폐 조직 파라핀 등에 매립 이차 절차 허용 흐트러 그대로 또는 여기 제시 QRT-PCR 분석한다는 것이다. 그러나, QRT-PCR은 theoretica이기 때문이다에서야 검출 더 민감한 법안은 총 평가는 폐에 존재하는 종양 세포의 낮은 숫자를 공개하지 않을 수 있습니다. 유용한 반면, 상기 이미징 기술은 치환 될 수 있거나, 현재 설명 QRT-PCR 방법으로 보충. QRT-PCR은 폐에서 종양 유래의 mRNA의 민감한 측정을 제공하는 잠재력을 가지고있다.

<table><tbody><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA 분리 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript 역전사 슈퍼믹스 QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr>용 <tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR SYBR 그린 어세이: ERBB2, 인간&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 그린 어세이를 위한 PrimePCR 템플릿: ERBB2, Human&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>gapdh 프라이머 시퀀스</td><td></td><td></td><td>For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

정량 실시간 pcr에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

전이성 질환 먼 기관에 차 암 사이트에서 악성 종양 세포의 확산된다 암 관련 사망의 1 차 원인이다. 전이성 확산의 일반적인 사이트는 폐, 림프절, 뇌, 뼈 (2)를 포함한다. 전이를 구동 메커니즘은 암 연구의 강렬한 영역입니다. 전이 먼 사이트는 암 연구를위한 수단이다에 따라서, 효과적인 분석은 전이성 부담을 측정합니다. 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가는 일반적으로 다음 해부 폐 조직의 육안 관찰에 의해 정성 행한다. 전이를 평가하는 정량적 방법은 현재 생체 외 및 사용자 정의 된 매개 변수를 필요로 생체 내 이미징 기반 기술에 제한됩니다. 이들 기술의 대부분은 오히려 세포 수준 3-6보다 전체 유기체 수준이다. 다 광자 현미경을 이용하여 새로운 이미징 방법 METAS을 평가할 수 있지만세포 수준에서 7 TASIS이 매우 우아한 절차는 보급의 메커니즘보다는 전이성 부담의 정량적 평가를 평가에 더 적합하다. 여기에 정량적으로 전이를 평가하는 간단한 체외 방법이 제공된다. 정량 실시간 PCR을 사용하는 것은 (QRT-PCR), 특정 종양 세포의 mRNA는, 마우스 폐 조직 내에서 검출 될 수있다.

시간을 초과가 실험 동물 내로하면 종양 세포의 초기 접종을 수행하는 데 걸리는 행하는, 생체 내 종양 분석, 조직 수확 RNA 분리 및 QRT-PCR 분석에 기본이 1-2 일 과정이다 (도 1) . 총 분석의 예는 폐 조직 내에서 종양 세포를 평가하기위한 생물 발광 이미징이다. 여기서, 유방 종양 실험은 ACT1라는 갭 정션 connexin43에 단백질을 대상으로 임상 에이전트, 폐에 루크 4T1 유방 종양 세포의 자발적인 전이를 저해 할 여부를 평가하기 위해 수행 하였다. 치료, 위약 또는 테스트 에이전트를받은 동물의 몇 주 후 루시페린 주입과 희생되었다. 해부시, 폐 루시 페라 생물 발광에 대한 가시화되었다. 대표 이미지는 약물로부터의 폐를 나타납니다처리 된 동물은 종양 세포가 ACT1 치료 <...

이 프로토콜은 마우스 폐 조직 내에서 전이를 나타내는 특정 종양 세포의 mRNA를 검출하도록 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)을 사용하는 방법을 설명한다.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 전이를 분석하는 방법으로서 폐의 종양 세포로부터 특정 mRNA의 양을 검출하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 전이를 정량적으로 측정할 수 있다는 점입니다. 폐 종양 적출을 수행하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 치사량의 isofluorine을 사용하여 마우스를 안락사시킨 후, 마우스의 사지를 벌려 등에 닿게끔 폼 보드 위에 놓고 적출 핀을 사용하여 보드에 고정하십시오.에탄올로 마우스를 분무한 후, 핀셋으로 동물의 하단 중앙 부분을 잡고, 가위로 피부를 통해 목 방향으로 위쪽을 향해 절개하되, 마우스의 복강을 찌르지 않도록 주의하십시오. 이제 동물의 하단 끝부분에서 복막을 잡고, 목 기저부 방향으로 위쪽을 향해 절개를 시작하십시오. 흉강 내로 출혈이 발생할 수 있는 혈관을 절단하지 않도록 주의하면서 흉곽의 좌우 측면을 따라 조심스럽게 절개하십시오.횡격막과 흉곽의 상단부를 가로질러 좌우로 절개하여 갈비뼈를 제거합니다. 그 다음, 포셉을 사용하여 마우스의 기관을 잡고 앞으로 당긴 뒤, 해부 가위로 기관을 절단하여 마우스에서 폐를 적출합니다. PBS를 사용하여 폐 조직을 부드럽게 세척합니다.그 다음, 텍스트 프로토콜에 따라 폐 조직의 육안 평가를 수행한 후, 폐를 즉시 분석해야 하는 경우 RNA 분리로 진행하십시오. 조직에서 RNA를 분리하려면, 텍스트 프로토콜에 나열된 방법 중 하나를 사용하여 조직을 균질화하는 것부터 시작하십시오. RNA 분리 키트의 용해 버퍼를 준비하고, 용해 버퍼 1mL당 20µL의 tumor captoethanol을 추가하십시오.30g의 조직마다 300µL의 용해 버퍼(lysis buffer)로 재현탁하고, 진폭을 30%로 설정한 초음파 분쇄기로 조직을 10초 동안 처리합니다. 590µL의 TE 버퍼에 10µL의 protinase K를 첨가한 후, 이 버퍼 600µL를 초음파 처리된 조직 300µL에 추가합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다.다음으로, 잔해물을 제거하기 위해 샘플을 13,000 ×g 이상에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. RNA를 침전시키기 위해 상층액 900 µL당 450 µL의 에탄올을 첨가합니다.그런 다음 라이세이트 에탄올 혼합액 700 µL를 RNA 컬럼으로 옮깁니다. RNA가 컬럼에 결합할 수 있도록 13,000 ×g 이상의 속도로 1분 동안 다시 원심분리합니다. 그 후 폐액을 버리고, 남은 상청액을 컬럼에 넣고 다시 원심분리합니다.다음으로, 컬럼의 상단부에 350 µL의 wash buffer one을 첨가하고 샘플을 30초 동안 원심분리합니다. 폐액을 버리고 컬럼을 튜브에 다시 장착합니다. 각 샘플당 5 unit의 DNase one 효소와 5 µL의 10X DNase buffer, 그리고 40 µL의 DNase RNase free water를 혼합하여 DNase를 준비합니다.각 컬럼에 DNase mix 50 µL를 첨가하고, 상온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 컬럼에 wash buffer one 350 µL를 첨가하고 샘플을 30초 동안 원심분리합니다. 폐액을 버린 후, wash buffer two 600 µL를 첨가하고 30초 동안 추가로 원심분리합니다.액체를 버린 후 250 µL의 세척 버퍼 2(wash buffer two)를 넣고 2분 동안 원심 분리합니다. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고, 컬럼에 50~100 µL의 RNase/DNase-free water를 추가합니다. 1분 동안 배양한 후, 1분 동안 원심 분리합니다.RNA 수율을 높이기 위해 수집한 용출액을 컬럼에 다시 통과시킵니다. 즉시 사용하려는 경우 샘플을 얼음에 보관하십시오. 나중에 사용할 경우 드라이아이스나 액체 질소로 급속 냉동한 후, 필요할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.분광광도계를 사용하여 RNA를 정량합니다. 그 다음, 멸균된 RNase/DNase free PCR 튜브 또는 플레이트에 이 표에 표시된 대로 0.5~2 $\mu\text{g}$의 총 RNA를 사용하여 1차 전사 합성용 반응 혼합물을 준비합니다. 혼합 후 가볍게 원심 분리하고, 여기에 제시된 프로그램을 사용하여 표준 PCR 기기를 설정합니다.반응이 완료되면 멸균된 뉴클레아제 프리 워터를 사용하여 최종 반응액을 원하는 부피로 희석하십시오. 실시간 PCR을 수행하려면 human HER2와 같은 양성 대조군 cDNA를 사용하여, cDNA를 1~4회 연속 희석하여 5개의 표준물질을 준비함으로써 각 프라이머 세트에 대한 표준 곡선을 설정하십시오. 다음으로, 표준 곡선과 실험 시료를 모두 포함한 전체 시료 수를 계산하십시오.그 다음, 멸균된 RNase 및 DNase-free 튜브에 각각의 실험 대상 유전자와 gapdh와 같은 내부 대조군을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 표준 또는 실험 샘플당 1 µL의 cDNA가 포함된 테스트 플레이트를 준비하십시오. 각 프라이머 프로브당 웰 하나당 최소 하나의 cDNA 샘플을 할당합니다.각 프라이머 프로브에 대해 웰당 19 µL의 마스터믹스를 추가합니다. 이 생물발광 실험은 gap junction 단백질인 Connexin 43을 표적으로 하는 ACT1으로 처리한 마우스 폐에서 루시퍼레이스 활성이 음성으로 나타나며, 이는 조직 내에 종양 세포가 없음을 시사한다는 것을 보여줍니다. 그러나 폐 조직의 H&E 절편 분석 결과 루시퍼레이스로 조명되지 않은 미세전이가 확인되었으며, 이는 루시퍼레이스 영상 기술이 적은 수의 종양 세포를 검출하기에는 민감도가 충분하지 않음을 시사합니다.마우스의 기억 지방 패드(memory fat pad)에 원래 이식된 세포로부터 유래한 폐 조직 내의 인간 HER2 양성 JIMT1 종양 세포를 검출하기 위해 HER2 특이적 프로브를 사용한 qRT-PCR 실험 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 모든 폐에서 육안으로 확인 가능한 전이는 관찰되지 않았으나, 11개의 샘플 중 2개에서 qRT-PCR을 통해 전이가 검출되었습니다. 이 그림에서는 세포 수 계열에서 마우스 폐 gapdh로 표준화된 상대적 HER2 수준을 결정하기 위해 표준 곡선 분석이 준비되었습니다.결과는 HER2 프로브를 이용한 qRT-PCR이 단 10개의 세포에서도 HER2 수치를 검출할 수 있을 만큼 충분히 민감함을 나타냅니다. 마지막으로, 이 회귀 분석은 양성 및 음성 대조군을 포함하여 각 폐 샘플의 상대적인 세포 수를 보여줍니다. 숙련된 경우, 적절하게 수행한다면 이 기술은 6~8시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, RNA 분리 및 역전사 반응 과정 동안 RNA의 무결성을 유지하기 위해 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 정량적 실시간 PCR을 통해 전체 폐 조직에서 전이를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간의 전립선 암이 동 소성 모델에 폐 종양 세포와 구별 전이의 형성을 순환, 종양 크기의 정량을 허용한다. 세포가 일차 장기 탈출해야 같이, 혈류를 입력하고, 보조 사이트에 이식,이 모델은 인간에서 효과적으로 시나리오 되풀이되었습니다.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

이 프로토콜의 목표는 유방 종양 형성을 연구하는 것입니다. 이 기술을 사용하면 마우스 유방 종양을 제거하고 종양에서 일차 세포를 준비할 수 있습니다. 폐 전이를 연구하기 위해 폐 추출 프로토콜이 포함되어 있습니다. 또한, 마우스 배아로부터 마우스 배아 섬유아세포를 분석하기 위한 또 다른 프로토콜이 포함되어 있습니다.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 선암종 마우스 모델의 폐에서 종양 결절 발달을 감지하는 방법과 시간 경과에 따른 결절 크기 및 치료에 대한 반응 변화를 모니터링하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 평가의 정확성은 종말점 조직학적 정량화로 확인되었습니다.

종양 개발의 평가를 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용하고 후속 치료에 대한 반응의를 폐암의 마우스 모델에서

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

유방암 전이를 목표로하는 보조 요법을 평가하는 전임상 모델이 부족합니다. 이를 해결하기 위해, 우리는 de novo 폐 유방 선암 전이의 마우스 모델을 개발했는데, adjuvant setting (원발 종양의 수술 후 절제술)에서 투여 된 치료법은 이전에 파종 된 폐 전이에 영향을 미치는 효능을 평가할 수 있습니다.

전임상 마우스 모델에 대한 수술 절차 및 방법론 드 노보 유방암 전이

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

Murine orthotopic 유 방 암 모델 및 과격 한 유 방 절제술 모델 인간의 유방암 암 진행을 모방 하기 위해 종양 부담 척도를 생물 발광 기술을 소개 합니다.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

배우세요 정량 실시간 PCR을 사용하여 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이를 평가하는 방법을. 종양 특이적 mRNA를 검출하여 전이 수준을 정량적으로 분석하는 이 기술은 암 연구에 필수적인 도구입니다.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

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