高效分离人腭扁桃体中B淋巴细胞和T淋巴细胞的实验方案

本实验的总体目标是从人扁桃体样本中获取BNT淋巴细胞组分。该方法有助于回答病毒学领域的一些关键问题，例如BT淋巴细胞组分在病毒性疾病发病机制中的作用是什么。在手术切除后三小时内，将扁桃体组织置于含有冰上预冷、无菌且添加了补充成分的HBSS溶液的50毫升离心管中，运送至实验室。

然后采用推荐用于处理人体组织的适当生物安全操作程序。用含有补充成分的新鲜HBSS润湿组织，并将扁桃体转移至冰上一个60毫米的塑料细胞培养皿中。使用镊子去除所有可见的血块、脂肪组织和结缔组织，然后将扁桃体转移至另一个含有5毫升添加补充成分的HBSS的新60毫米培养皿中。

接下来，将扁桃体组织块切割成 3 至 10 毫米大小的碎片，然后用塑料注射器的推杆末端将碎片转移至一个新的含有 10 毫升添加补充物的新鲜 HBSS 的 60 毫米细胞培养皿中的 100 微米塑料细胞筛网上。用力将组织碎片挤压通过细胞筛网，确保在所有组织均被研磨完毕后，扁桃体碎片始终完全浸没于 HBSS 中。弃去筛网，将所得的细胞悬液转移至置于冰上的 50 毫升塑料离心管中。

用含有补充物的新鲜HBSS将细胞悬液调整至终体积35毫升，然后向几支50毫升锥形管中各加入10毫升室温密度梯度溶液。小心地将细胞悬液缓慢铺加在密度梯度液上方，注意避免溶液混合，随后通过离心分离细胞。单个核细胞将在界面处形成一层松散的白色絮状层，而红细胞、成纤维细胞及细胞碎片则位于管底沉淀中。

使用10毫升移液管，小心收集单个核细胞层，并将单个核细胞转移至一个新的50毫升离心管中。随后每次用25毫升冰浴PBS洗涤细胞，共洗涤三次，最后将细胞沉淀重悬于15毫升PBS中。计数活细胞数量后，将细胞置于冰上，以便通过磁珠分选法分离tonsor T细胞。

将单个核细胞悬液离心，每1×10⁷个细胞用80 µL预冷的分离缓冲液重悬沉淀。随后将细胞悬液转移至无菌的2 mL离心管中，加入20 µL CD3磁性抗体，在4°C下孵育1小时，期间持续轻柔混匀以保持细胞处于悬浮状态。孵育结束后，将细胞转移至含有5 mL预冷分离缓冲液的15 mL离心管中进行洗涤。洗涤过程中，将磁力分离器固定于支架上，并将分离柱装入磁铁装置中。

用500微升冰上预冷的分离缓冲液洗涤层析柱，然后在柱子上方放置一个40微米的滤网。将细胞沉淀重悬于500微升新鲜分离缓冲液中，通过滤网将细胞加载到层析柱上，收集含有B细胞的流出液（EIT）至一个15毫升的锥形管中。当所有细胞均通过层析柱进入收集管后，置于冰上保存。

每 1 × 10⁷ 个待处理细胞，用 500 微升分离缓冲液洗涤柱子四次，每次需等待柱子储液区完全排空后再进行下一次洗涤。最后一次洗涤后，将柱子转移至新的 15 毫升收集管中。然后使用柱塞将 2 毫升分离缓冲液推过柱子，流入收集管，以获得 CD3 阳性 T 细胞组分。

为了分析分离的B细胞和T细胞组分，将CD3阳性与CD3阴性细胞组分分别离心沉淀，并在第二次离心后用含有0.2% BSA的1毫升PBS（即PBSA）洗涤两组细胞。将细胞与PBSA混合液按每管100微升分装至适量数量的流式管中用于荧光标记，并向每管加入适量的Fluoro 4偶联单克隆抗体或对照抗体。随后短暂涡旋混匀各管，并在4°C避光条件下孵育30分钟，孵育结束后进行后续操作。

用新鲜的 PBSA 将试管洗涤两次，然后用 1%多聚甲醛固定细胞染色，以通过 PCR 检测细胞中腺病毒 DNA 的存在。在适当的循环条件下进行 PCR 扩增，将所得的 PCR 扩增产物在含 EDTA 缓冲液的 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳分离。最后，使用适当的核酸染料显色观察结果条带。

根据标准操作规程，通过抗CD20和抗CD2抗体进行流式细胞术分析证实，单个核细胞的有效分离可获得高度纯化的B细胞和T淋巴细胞亚群。相反，单个核细胞分离效率低下时，所得细胞组分将包含B淋巴细胞和T淋巴细胞的混合物。如上所述，可从磁珠分离的B细胞和T淋巴细胞亚群中提取DNA和RNA，用于后续分析。

例如，此处通过 PCR 检测显示，在 TONSOR T 淋巴细胞中可特异性检测到腺病毒 DNA，具有良好的细胞质质量。RNA 也可从分离的 TONSOR B NT 淋巴细胞中提取。只要操作得当，两个扁桃体样本可在六小时内完成处理。

在进行该操作时，应尽快处理扁桃体样本。洗涤步骤的次数和洗涤缓冲液的体积也是获得良好结果的关键参数。按照本方案操作后，还可采用其他方法，如定量PCR（QPCR）和逆转录定量PCR（R-T-Q-P-C-R），以进一步探究病毒DNA和mRNA在其发育后定量存在的相关问题。

该技术为病毒学领域的研究人员探索不同病毒在人类淋巴组织中的致病机制和潜伏特性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从人类扁桃体样本中分离BT淋巴细胞组分。请务必注意，操作未经筛查的人源材料（如血液和组织）可能存在极高风险。

因此，应遵循适当的安全操作规范。