Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten die geactiveerd zijn in het zebravissenembryo immunolokaliseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de ontwikkelings- en celbiologie, zoals de lokalisatie en activatie van gefosforyleerde eiwitten in een volledig embryo. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men calciumafhankelijke signalering in een volledig embryo kan lokaliseren door eiwitten die door calcium worden geactiveerd immuunhistochemisch te kleuren.

Nadat wild-type of transgene embryo's zijn verkregen volgens het tekstprotocol, voegt u 0,003% PTU toe aan de embryo's in systeemwater om pigmentatie te blokkeren en incubeert u deze tot de gewenste ontwikkelingsfase. Wanneer de embryo's de juiste fase hebben bereikt, voegt u MESAB toe aan de schaal om de vissen te anesthetiseren. Zodra de vissen zijn geanestheseerd, verwijdert u zoveel mogelijk systeemwater, waarna u verse 4% PFA en PBS toevoegt en drie tot vier uur incubeert bij kamertemperatuur.

Verwijder na de incubatie de PFA en vervang deze door 100% methanol. Bewaar de embryo's vervolgens gedurende ten minste 48 uur bij -20 °C. Voor het uitvoeren van de immunokleuring plaatst u minimaal 10 embryo's per experimentele conditie in gelabelde microcentrifugebuisjes van 1,5 mm.

Wanneer de embryo's naar de bodem van de buis zijn gezakt, verwijdert u de methanol en gooit u deze weg. Gebruik vervolgens opeenvolgende wasbeurten met afnemende concentraties ethanol in PBTx om de embryo's te rehydrateren. Verwijder de laatste PBTx-wasstap en voeg 0,5 milliliters 10% normaal geiten serum of NGS in PBTx toe. Incubeer dit vervolgens gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden.

Verwijder vervolgens de oplossing en voeg 0,2 tot 0,5 milliliter van een 1 op 5 verdunning van muis anti-geacetyleerd tubuline monoklonaal antilichaam en 10%NGS en PBTx toe. Incubeer de embryo's gedurende de nacht bij kamertemperatuur met voorzichtig schudden. Verwijder en gooi de volgende ochtend het antilichaam weg en voer drie wasbeurten uit met gebruik van 0,5 milliliter 2%NGS en PBTx, telkens vijf minuten lang met voorzichtig schudden.

Dim de plafondverlichting en voeg aan elk monster 500 µL toe van een 1 op 500 verdunning van fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam in 10% NGS en PBTx. Incubeer vier uur lang in het donker bij kamertemperatuur met zacht schudden. Was de embryo's na de incubatie drie keer.

Voor co-immunokleuring voegt u een 1:20 verdunning van anti-phospho CaMKII antilichaam toe. Incubeer dit gedurende de nacht in het donker onder zachte schudding. De volgende ochtend, na het drie keer wassen van de embryo's met 2%NGS en PBTx, voegt u een 1:5 verdunning van rood 568 fluorescent geconjugeerde geit anti-konijn IgG en 10%NGS en PBTx toe.

Na vier uur incuberen in het donker bij kamertemperatuur, worden de embryo's drie keer gewassen en bewaard in PBTx of 50% glycerol in PBS, afhankelijk van de beeldgevingsprocedure. Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, plaatst u één tot vijf embryo's op een glazen objectglas. Gebruik aan weerszijden van de vis vier gestapelde fragmenten van dekglas nummer één om een kamer te creëren.

Plaats vervolgens een dekglas bovenop. Breng met behulp van de 100X olie-immersielens en doorlatend licht een enkel embryo in focus. Schakel het licht uit.

Zet de confocale microscoop aan met de juiste lasers en activeer de remote focus. Open het confocale programma en selecteer in de acquire-balk de juiste objectief. Klik vervolgens in de XY-basisbalk op de 1024-knop om de beeldgrootte in te stellen.

Klik in de laser- en detectorbalk op de rode 488- en groene 568-vakjes om de laserdetector voor elk kanaal in te schakelen en stel het pinhole-diafragma in op medium. Pas vervolgens in de gain-balk de versterking voor elk kanaal aan om deze te visualiseren. Klik daarna in de acquisitie-instellingenbalk op live om te beginnen met het vastleggen van beelden.

Vink in de balk met weergave-instellingen het vakje 'force integral zoom' uit om in het live-venster te centreren. Loop in de balk met acquisitie-instellingen onder het Z-tabblad door de lagen van het beeld. Nadat het aantal lagen dat in het beeld moet worden opgenomen is geselecteerd, gaat u naar een punt in het midden van het Z-vlak.

Klik onder het tabblad Z op het kleine rode referentievakje. Hiermee wordt de RFA genulled op het punt dat als centrum is gekozen. Selecteer in het vak met het label stapsgrootte de dikte van de lagen.

Let op het vak voor de bestandsgrootte en probeer de bestanden te beperken tot één gigabyte. Om de bovenste extreme van het beeld te vinden, klikt u op de cirkel naast 'top' en navigeert u door de Z-lagen. Klik vervolgens op de cirkel naast 'bottom' en de computer gaat terug naar de laag als centrum.

Klik vervolgens in het vak met de acquisitie-instellingen opnieuw op live om de laseracquisitie te stoppen. Klik in dit paneel op de rode vakken met de labels average en Z stack. Deze vakken worden vervolgens groen.

Klik in het vak met acquisitie-instellingen op 'single' om de volledige reeks beelden te verwerven. Volg de voortgang terwijl er in beide kanalen en door de gehele Z-stapel wordt gescand. Klik om op te slaan op het volumewindow, klik op 'save as' en benoem het bestand.

Om het bestand als volume-rendering weer te geven terwijl de Z-stapel nog open is, selecteert u het vervolgkeuzemenu 'data' en klikt u op 'volume render'. Sla het gerenderde bestand op als een .tif-bestand. Deze figuur toont immuunkleuring voor P-CaMKII en geacetyleerd tubuline, wat een standaardmarker is voor cilia in de Kupffer-blaasje of KV van de zebravis. Bewegende primaire cilia genereren een circulaire vloeistofstroom, wat leidt tot een stijging van calcium in de gecilieerde cellen die de KV bekleden en de activatie van CaMKII op specifieke locaties, zoals hier te zien is.

Deze figuren tonen P-CaMKII zoals dit voorkomt op het apicale oppervlak van gecilieerde cellen die specifieke regio's van de perinefrische gangen bekleden tussen 24 en 72 uur na bevruchting of HPF. Bij één dag ontwikkeling behoudt het met PFA en methanol gefixeerde embryo-oor van de zebravis zijn structuren, wat de detectie van CaMKII-kleuring aan de basis en langs de lengte van het kinocilium mogelijk maakt. Bij 72 HPF werd het binnenoor tegengekleurd met Alexa 488 phalloïdine en anti-geacetyleerde tubuline met Alexa 568.

De PFA-methanolfixatie behield zowel F-actine als tubuline. Deze vis van 30 HPF expressieerde een membraangebonden GFP, dat verloren zou gaan bij methanolfixatie. PFA-fixatie resulteerde in een verminderd P-CaMKII-signaal vergeleken met fixatie met PFA en methanol.

In dit stadium van de ontwikkeling is het signaal echter sterk genoeg om zonder methanol te worden gedetecteerd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om verse embryo's en verse vrije agentia te gebruiken.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u fosfoproteïnen in zebravissenembryo's kunt lokaliseren.