매우 낮은 밀도에 대한 단순화 된 방법, 장기 차 해마 신경 세포 문화

이 절차의 전반적인 목표는 면역세포화학 표지 및 신경세포 자율 메커니즘 연구를 촉진하기 위해 초저밀도에서 일차 마우스 해마 뉴런의 건강한 장기 배양을 확립하는 것입니다. 이 연구는 발달 기능의 신경 형태학에서 단백질의 특이성에 대한 연구와 같은 신경 과학 연구 분야의 몇 가지 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경교 피더 층의 지원 없이 커버 슬립에서 뉴런이 초저밀도로 성장

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 학생인 Mariel Piechowicz입니다. 2개의 고밀도 플레이트와 2개의 저밀도 24웰 플레이트를 준비합니다. 28 게이지 바늘을 사용하여 24개의 웰 플레이트의 바닥을 에칭하여 옮겨진 플라스틱이 저밀도 뉴런이 자라는 커버 슬립을 지지하는 역할을 하도록 합니다.

멸균 유리 커버 슬립을 저밀도 배양용으로 지정된 두 개의 24웰 플레이트로 옮깁니다. 붕산염 완충액에 희석된 밀리리터당 0.1밀리그램 Poly-D-lysine 300마이크로리터로 4개의 플레이트를 모두 코팅하고 야간 배양 코팅을 위해 인큐베이터에 다시 넣습니다. 조직을 채취하기 전에 얼음처럼 차가운 멸균 HBSS로 채워진 10cm 페트리 접시 2개를 준비합니다.

현미경으로 들여다보아, 겸자로 배아의 목을 잡고 소뇌 수준 아래의 정중선에서 첫 번째 절단을 합니다. 그런 다음 두개골 바닥의 왼쪽을 자릅니다. 다음으로, 두개골 바닥의 오른쪽을 다시 자릅니다.

두개골 뼈와 피부 조직의 작은 부분을 자르지 않은 상태로 두어 뇌 전체를 쉽게 추출할 수 있도록 합니다. 이제 뇌를 HBSS 솔루션으로 옮깁니다. 뇌를 검사하여 심하게 절단된 영역이 없이 손상되지 않았는지 확인합니다.

그런 다음 절차를 반복하여 20ml의 차가운 HBSS 완충액이 들어 있는 새로운 페트리 접시에 나머지 배아 뇌를 수집합니다. 각 뇌의 복부 쪽이 위로 향하도록 배치합니다. 꼬리 끝에 있는 집게로 뇌를 누른 상태에서 날카로운 핀셋으로 중간 꼬리 지점과 꼬리 측두부 사이를 대각선으로 자릅니다.

다른 반구에 대해 이 작업을 반복합니다. 그런 다음 해마가 손상되지 않은 두 반구를 뇌의 나머지 줄기 조직과 분리합니다. 모든 뇌에 대해 절차를 반복하고 해부된 모든 반구를 함께 모읍니다.

그런 다음 두 쌍의 핀셋을 사용하여 수막을 제거합니다. 발달 중인 해마(hammerpocampus)를 측두엽(temporal lobe) 안쪽으로 접혀 있는 구부러진 구조로 확인하고 인접한 피질 조직(cortical tissue)과 분리합니다. 모든 해마 조직을 모으고 모으십시오.

이 절차에서 절개된 모든 해마를 15ml 원추형 튜브의 효소 분해 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 수조에 넣고 섭씨 37도에서 25분 동안 배양합니다. 25분 후 효소 용액을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 5ml의 따뜻한 세척 매체를 추가하여 총 부피를 10ml로 만듭니다. 튜브를 천천히 5회 뒤집어 조직을 부드럽게 씻습니다. 세척 매체를 제거하고 추가 세척을 위해 10ml의 세척 매체를 다시 추가합니다.

그런 다음 세척 매체를 제거하고 3ml의 신선한 따뜻한 세척 매체를 다시 첨가하십시오. 손으로 튜브를 15회 세게 흔들어 조직에서 소화된 뉴런을 제거합니다. 배지는 세포가 조직에서 세척 매체로 분리되면 탁해져야 합니다.

그런 다음 새로운 15ml 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 튜브에 남아 있는 조직은 그대로 둡니다. 그 후, 조직에 2ml의 세척 매체를 더 넣고 플라스틱 피펫으로 15회 분쇄하여 남은 조직을 부드럽게 분리합니다. 세포 현탁액을 5분 동안 그대로 두었다가 수집된 쉐이크오프 세포가 들어 있는 새로운 15리터 원뿔형 튜브에 모읍니다.

그런 다음 혈구계로 뉴런의 밀도를 계산합니다. 250, 밀리리터 당 000 뉴런의 조밀도를 산출하기 위하여 필요로 한 세포 현탁액을 산출하고, 고밀도 신경 세포 도금 매체를 생성하기 위하여 완전한 배양 매체의 30 밀리리터를 포함하는 2개의 원뿔 관의 한에 그것을 추가하십시오. 이 고밀도 신경 해결책의 1.2 밀리리터를 완전한 배양 매체의 다른 30 밀리리터에 옮기십시오, 10의 농도를 산출하기 위하여, 밀리리터 당 000의 신경 세포, 그리고 저밀도 덮개 미끄러짐을 씨를 뿌리기 위하여 이 해결책을 이용하십시오.

이 절차에서는 고밀도 뉴런을 위해 바닥이 에칭된 24웰 플레이트를 배양 후드에 배치합니다. 진공에 의해 사전 조절된 매체의 300 마이크로리터를 제거하고, 그 후에 250, 밀리리터 당 000의 신경에 고밀도 세포 현탁액의 0.6 밀리리터를 도금하십시오. 커버 슬립이 있는 다른 24웰 플레이트 2개를 배양 후드에 놓습니다.

진공 장치에 의해 전소화된 매체의 300 microliters를 제거하고, 10, 덮개 미끄러짐에 milliliter 당 000 neurons에 저밀도 세포 현탁액의 0.6 millilit를 도금하기 전에. 그런 다음 4개의 24웰 플레이트를 모두 인큐베이터에 다시 넣고 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 고밀도 배양에 뉴런이 부착된 저밀도 커버 슬립을 뒤집고 뉴런이 서로 마주보고 있는지 확인합니다.

그런 다음 공동 배양이 있는 두 개의 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다. DIV 5에서 300마이크로리터의 신선 사료 배지를 추가하여 공동 배양에 공급합니다. 이 초기 공급 후 매주 각 웰에 시토신 아라비노사이드가 없는 300마이크로리터의 신선 사료 배지를 추가합니다.

배양액을 한 달 이상 보관하는 경우, 1개월 시점을 넘어서면 매주 배지의 절반을 신선한 사료 배지로 교체하십시오. 형태학적으로 고밀도 뉴런과 저밀도 뉴런 모두 최대 3개월까지 건강해 보여야 합니다. 여기서, 면역세포토미법 라벨링은 NMDA 수용체 소단위 NR1 및 ApoE 수용체 소단위 GluR1이 이중 염색으로 표지된 기능적 글루타메이터 시냅스를 나타내는 데 사용됩니다.

그리고 기능적 시냅스는 이미지 J를 사용하여 쉽게 식별하고 정량화할 수 있습니다.저밀도 뉴런은 또한 축삭돌기 단백질 마커 p-Tau와 함께 수지상 단백질 마커 MAP2에 대한 항체로 표지됩니다. 이 이중 라벨링을 통해 수상돌기와 축삭돌기를 명확하게 구별할 수 있습니다. 저밀도 배양물은 인산칼슘 방법을 사용하여 DNA 플라스미드로 성공적으로 transfection할 수도 있지만, transfection 속도는 일반적으로 후기 단계에서 매우 낮습니다.

이 그림은 EGFP transfection이 신경 세포 형태를 드러내고 미세한 수지상 척추 구조를 보이게 할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, 개념 증명으로, 초저밀도 뉴런은 오탑스 형성을 촉진하는 조건에서 성장할 수 있습니다. Poly-D-lysine 코팅된 마이크로아일랜드에서 자란 이러한 초저밀도 autaptic 뉴런은 이 공동 배양 프로토콜을 통해 고밀도 피더 뉴런에 의해 2개월 이상 유지될 수 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행되면 세포 배양 당일에 2-3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 유리 커버 슬립과 24웰 플레이트 바닥을 Poly-D-lysine으로 코팅하는 것이 중요합니다. 플레이트 바닥의 간단한 에칭은 커버 슬립에서 자랄 수 있도록 저밀도 해마 뉴런에 기계적, 영양적 지원을 제공하는 데 적합합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신경교 피더 층이 없는 상태에서 초저밀도 1차 마우스 배아 해마 뉴런을 성장시키는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법을 자신의 실험 목적으로 활용할 수 있기를 바랍니다.