Name: Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin, C1498 hücreleri ve indükledikleri akut lösemi için fare modeli karakterizasyonunu. Akut miyelomonositik lösemi mekanizmalarını anlamak ve yeni tedavileri test etmek için akış sitometrisi ve sitokimya kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, bu çalışmayı destekledikleri için "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) ve Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille'e (IRCL) teşekkür eder. Fareleri barındırdıkları ve refahlarını sürdürdükleri için Delphine Taillieu ve hayvan tesisi personeline teşekkür etmek istiyorlar. Ayrıca Raphaëlle Caillerez ve Nathalie Jouy'a mikroskopi ve akış sitometrisi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
<li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li>
<li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498%5BTitle%5D)+AND+%22Ohio+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li>
<li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8%2B+T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li>
<li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li>
<li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).</li>
<li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+JP+%22Handbook+of+Flow+Cytometry+Methods%22">Handbook of Flow Cytometry Methods</a>. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).</li>
<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
<li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pak.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li>
<li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuesenberry%2C+PJ+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 299 (2), 71-75 (1978).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li>
<li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Daha önce yapılan çalışmalarda, C1498 hücre çizgisi, akut granülositik 5, 6 ya da miyelomonositik NKT 7 hücre lösemi bir teşvik edici olarak tanımlanmıştır. Ancak literatürde demonstrasyon veri yok veya eksik ya idi. Burada sunulan protokol gibi flow sitometri, immünofloresans, MGG boyama ve sitokimyasal tahlilleri gibi farklı teknikler, kültürlü C1498 hücreleri karakterize etmek ve onlar enjekte edildikten sonra farelerde olduğu lösemi doğasını belirlemek için kullanır. Bu immün sonra in vitro kültür C1498 hücrelerinde fenotiplenir ve sitometrisi analizi yapıldı akışındaki Bu hücreler daha önce literatürde 6,7 tarif edilmiştir birkaç hücre yüzeyi hematopoietik belirteçleri olmasından ötürü, bazı sınırlamalar görülmektedir. Bizim sonuçları ile uyum içinde, Labelle ve ark. Akış cytomet kullanarak C1498 hücreleri üzerinde olgun TCR hücre yüzey ekspresyonunu dikkat etmediry boyama. Onlar CD3ε ve TCRVβ8.2 mRNA 7 algılandı sonra ancak, bir NKT hücre hattı olmalarını kabul. Ayrıca hücreler (&gt;% 70) çoğu TCRVβ zincirleri ve CD3ε moleküllerin hücre içi ekspresyonunu görülmektedir, ancak Mac-3 molekülünün birlikte hücre içi ekspresyonu, aynı zamanda orada dolayı hematopoietik soyların belirlenemedi. Myeloperoksidaz, MGG boyama ve sitokimya kullanılarak fonksiyonel esterazları analiz değerlendirmeler C1498 hücre hattının bir miyeloid kökeni vardı ve monoblastlardan ve miyeloblast oluştuğunu göstermiştir. Bu sonuçlar boyama flow sitometri analizi elde edilmiştir, Mac-3 + hücrelerinin yüzdesi ile uyumlu idi. Bu adımlar önemli deneyler temsil nicel olmamasına rağmen yapılacak. Aslında, hiç ya da F ifade eden hematopoietik hücrelerin soyu ile farklılaşma aşamasında karakterize etmek için en iyi, mevcut yöntem, şimdiye kadar, devamew spesifik fenotipik belirteçler. boyanma Flow sitometri C1498 hücreleri damardan enjekte edildikten sonra congenic farelerde akut lösemi gelişimini göstermek için yardımcı oldu. Periferik kan ve çeşitli organlarda sızmış CD45.2 + C1498 hücreleri izole edildi ve bunların frekansları belirlenmiştir. Niceleme da immünofenotiplendirme sonra doğal medüller ve dalak hücreleri analiz etmek için yapılmıştır. Onlar birkaç hematopoetik belirteçler ifade edilen C1498 hücre fenotipi organlarda incelendiğinde zaman Sınırlamalar rastlanmıştır (bunlardan sadece bir kaç B220 + idi). gözlenen akut lösemi doğasını, Mayıs-Grünwald Giemsa boyama ve monositik faaliyetlerinin analizini tanımlamak ve granülositik esterazlar kemik iliği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar C1498 hücreleri miyelomonositik lösemi başlangıcı açığa onların miyeloblastik ve monoblastik morfolojisi ve fonksiyonu korunmuş olduğunu göstermiştir. <p claspH hatalar sonuçların yanlış yorumlamalar yol açabilir, çünkü sitokimyasal reaksiyonlar ve MGG boyama yaparken bu protokolü açıklanan kritik adımlar için göz önüne alındığında s = &quot;jove_content&quot;&gt;, özel dikkat pH verilmelidir. granülosit ve lenfositler, yüksek pH değerlerinde, bu test için pozitif leke çünkü Örneğin, α-naftil butirat esteraz etkinliği sadece 6.0 pH&#39;da monositik hücreler için geçerlidir. Hücreleri oturtulması MGG boyama yapmadan önce tavsiye ve biz C1498 hücreleri kullanarak esteraz sitokimyasal reaksiyonları yaparken sadece CAF tespit tatminkar sonuçlar sağladığı gösterdi değildir. Sitometrisi numuneleri (örneğin, kan, kemik iliği, dalak hücreleri) her prosedür sırasında buz üzerinde tutulmalıdır CD115 molekülünün ekspresyonunu ve akış tarafından algılama korumak için. Hiçbir boyama flow sitometri ve / veya immünofloresan deneyleri, antikorların referans kendi depolama yeniden gözlenmesi durumundacommendations ve seyreltme kontrol edilmelidir. malzemeler / ekipman tablosunda belirtilen referanslar akış sitometri veya immünofloresan uygulamaları için seçilmiştir. Birincil / ikincil antikorlar veya konjuge fluorophores nedeniyle uygunsuz depolama faaliyetlerini kaybetmiş olabilir (örneğin, ışığa veya ısıya maruz kalma), yanlış seyreltme, geniş donma / çözülme veya kontamine tamponlar kullanılması. Onlar düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontrol çalıştırın. Fare kemik iliği ya da proteinleri eksprese ettiği bilinen dalağından alınan hücreler kullanın. yüksek arka plan ve non-spesifik boyama önlemek için, hücrelerin düzgün yıkanmış ve (Immünofloresan için) yüksek nemde tutulması ve talimat olarak antikorlar seyreltilmiş olduğunu emin olun. doğru örnek arka plan seviyesini belirlemek için izotip kontrol antikoru ve primer antikor için aynı konsantrasyon ve seyreltme kullanın. esteraz sitokimya deneyler için,reaktifler saflaştırılmış fare dalak granülositik (Ly6G +) ve monositik (CD115 +) hücreleri içeren pozitif ve negatif kontrol slaytlar kullanılarak test edilebilir. Bu çalışmada açıklanan prosedür C1498 hücrelerin enjeksiyonundan sonra farelerde gözlemlenen lösemik özellikleri birçok insan akut miyelomonositik lösemi 11,12 ortak ayırt edici ortak gösterdi. işgal lösemik hücrelerin olgun ve olgun olmayan (progenitör ve öncüler) medüller hematopoietik hücrelerin bir azalma ile sonuçlandı. monositik hücreler gibi C1498 hücreleri, periferik kandaki yüksek frekans (&gt;% 20) bulunmaktadır. Hepatomegali, splenomegali lösemik hücrelerin infiltrasyonu sonuçlandığı gözlenmiştir, ve B lenfositleri ve miyeloid hücrelerde önemli artışlar splenomegali birlikte gözlenmiştir. kan platelet sayıları hematoloji analiz cihazı kullanılarak tahmin edildiğinde trombositopeni gözlenmiştir. Bu gösteri olduN, in vitro deneyler kullanarak, C1498 hücreleri, çözünebilir faktörleri 13 salgılayan normal murin hematopoez inhibe. Birkaç tümörlü fare modellerinde, (monositik ve granülositik hücreleri dahil olmak üzere), olgun myeloid hücreleri, anti-tümör spesifik T hücresi aktivasyonunu ve çoğalmasını 14 inhibe eden dalak, kemik iliğinden geçirmek için gösterilmiştir. Bu durumda, kemik iliği gözlendi hematopoietik hücrelerin azalma hematopoez ve / veya bunların göç bir eksiklik ya da meydana gelmiş olabilir. Bu ikinci bir mekanizma, periferik kandaki monositoz varlığının veya dalakta büyütülmüş miyeloid fraksiyonların gözlem açıklayabilir. Hücreler geliştirilmiş dalak hematopoez türemiş olabileceğini de düşünülebilir. Olgun B ön-maddeleri 15 lenfositler gibi Gerçekten de, sabit durum koşulları altında, dalak B hücrelerinin, bazı alt-gruplar tespit edilmiştir. Ayrıca, inflamatuar koşullar altında, medullary kök ve progenitorlar hücreler olgun monositler 16 üretimini uyarmak için dalak taşınmaya gösterilmiştir. Bu protokol bize lösemi gelişiminde katılan ve ek fonksiyonel yanı sıra moleküler deneyleri bunu yapmak için istihdam edilmelidir mekanizmaları ile ilgili sonuçlara varmak için izin vermez. Ancak bu veriler akut miyelomonositik lösemi klinik özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi içermektedir ve değerlendirmek ve yeni terapötik ajanların etkilerini anlamak için araştırmacılara yardımcı olacaktır.

Akut miyeloid lösemi (AML) olgunlaşma farklı aşamalarında engellenir hematopoietik miyeloid hücrelerin kontrolsüz çoğalma ile karakterize edilir. Bu düzensizliği granülositik, monositik, eritrosit veya megaryocytic farklılaşma yolları 1 etkileyebilir. AML hücreleri trombositopeni, lenfopeni ve anemi ile sonuçlanır engelli hematopoez, yol, kemik iliğinde birikir. lösemi hücreleri, kan ve Lenfoid olmayan organları istila. C1498 fare modeli literatür kana işgali tarif kanser hücreleri 1941 bir lösemi 10 aylık bir C57BL / 6 (H-2b) dişi fare izole çünkü akut lösemi için bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır hematopoietik organları (örneğin, dalak ve lenf düğümleri) ve non-hematopoetik organların (örneğin, karaciğer, akciğer, yumurtalık ve böbrek) yüksek proliferatif C1498 hücreleri tarafından da bir IN ile enjekte edildikten sonratravenous, duyarlı farelere 2-4 içine deri altı veya intra-peritoneal rota. Ancak, bu fare modeli ya granülositik 2,5 veya miyelomonositik 6 lösemi uyardığı bildirildi. Daha yakın zamanlarda, 2002 yılında yayınlanan bir çalışmada, kemirgen NKT hücreli lösemi 7 olarak bu kanser türü tanımladı. Bu durumda, literatür, bu C1498 hücre hattının yapısı ve farelerde indükler ilişkili lösemi ile ilgili değişiklik gösterir. 70 - Bu tutarsızlıklar detaylı eksikliği ve hücrelerin hakkında güncel yayımlanan bilgilerin ve birçok çalışma 1950 yılında yapılmıştır çünkü genel olarak lösemi hastalığına başlıca nedeni vardır. Burada C1498 hücreleri tanımlama ve farelere damar içine enjekte edilmesiyle uyandırılır lösemi hastalığın doğasını analiz açıklamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokolün birinci bölüm, in vitro olarak kültür edilmiş C1498 hücre açıklama ayrılmıştır. floresan antiyüzey ve hücre içi hematopoietik belirteçler karşı organları akış sitometrisi kullanılarak fenotipi belirlemek için kullanıldı. miyeloperoksidaz varlığı immünofloresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi, onların hematopoetik soy ve farklılaşma sahne esterazların aktivitesini değerlendirmek için sitokimya kullanılarak değerlendirildi ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama yapıldı. C1498 Hücreler daha sonra farelere enjekte edildi ve indüklenen akut lösemi hastalığı Bu yazının ikinci bölümünde tarif edilmektedir. Aynı teknikler frekansları ve kemik iliğindeki lösemi ve içsel hücre, periferal kan, dalak ve non-hematopoetik organ (karaciğer, akciğer) fenotipleri belirlemek için kullanıldı. Bu protokol yüksek tekrarlanabilir ve burada sunulan veriler araştırmacılar yeni tedavi stratejilerinin etkilerini değerlendirmek için yardımcı olacaktır. Bu lösemi fare modeli zaten immünoterapi yaklaşımları test etmek için kullanılmıştırnd farklı kanser kemoterapötik ilaçları 8,9. Onların etkinliği tümör yükü ve sağkalım oranları evrimini belirlenerek değerlendirildi. Bu protokol tedavi sırasında lösemili ve diğer hematopoetik hücre popülasyonlarının dağılımı ve geçim hakkında ek bilgi sağlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>C1498 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b / BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Hücre kültürü reaktifleri< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta (Gibco, GlutaMAX Takviyesi)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Akış sitometrisi boyama reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fare karşıtı B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>klon RA3-6B2, son seyreltme 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare B220 biotin (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>klon RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-fare CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>klon 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD3 PE (2)</td><td>BD biyolojik bilimler</td><td>555275</td><td>klonu 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>klon 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>klon GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-fare CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>klon GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare CD8 biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>klon 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>klon 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-fare CD11a biyotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>klon M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>klon M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare CD16/32 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>klon 93, 1/400</td></tr><tr><td>saflaştırılmış anti-fare CD16/32 (FcR engelleme)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>klonu 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-fare CD18 biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>klon M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>klonu M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>klonu 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>klonu 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>klon 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>klon RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-fare CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>klon IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>klon 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD49b/Pan NK PE</td><td>&nbsp; BD biosciences</td><td>553858</td><td>klonu DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare CD80 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>klonu 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare CD86 biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>klon GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>klon M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-fare CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>klon AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>klon 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>klon A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>klon 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-fare CD274 (PD-L1) biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>klon MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>klon D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-fare Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>klon HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-fare Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotin (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>klon RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-fare Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>klon 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare MHC sınıf I (H-2Db) biotin</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>klon 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare MHC sınıf II (I-A/IE) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>klon M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-fare NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>klonu PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-fare TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>klon H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>streptavidin PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr><td>İmmünofloresan boyama reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare miyeloperoksidaz (ağır zincir antikoru)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 & mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; anti-keçi IgG (Texas Red coupled antikor)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst çözümü</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Montaj ortamı 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Esteraz sitokimyasal boyama reaktifleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naftol AS-D kloroasetat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Boya çözeltisi (Hızlı Kırmızı Menekşe LB Baz çözeltisi)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 tampon konsantresi (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum nitrit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Sitrat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi, %37</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-naftil bütirat çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum nitrit Tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Pararosanilin çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Metilen mavisi çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>montaj ortamı 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald Giemsa boyama reaktifleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald çözümü</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R çözümü&nbsp;</td><td>RAL Teşhisi</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/20</td></tr><tr><td>pH 6.8 tampon çözeltisi</td><td>RAL Diagnostics</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Diğer malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 1000 (100 mg / ml)</td> <td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin SEDAXYLAN (20 mg / ml)</td> <td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin albümin serumu (BSA) tozu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>PBS çözeltisi (1x konsantre)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf 0,5 M EDTA çözeltisi, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Ayırma çözeltisi (Pancoll Fare)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Lizis tamponu (Kırmızı Kan Hücreleri Parçalama Tamponu) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi (% 0.4)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>50 ml tüp (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 & m Hücre Süzgeci (Falcon)&nbsp;</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Oda & filtre kartı (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Camları, 24 x 24mm</td><td>Örgü Cam</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar (Starfrost - zemin kenarları 90)</td><td>Örgü Cam</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tüp</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipeti 150 mm (kılcal boru)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>26 G iğne</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; insülin şırınga ve iğne 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>30 G iğne&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Akış sitometri tüpleri (mavi)</td><td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>Su itici kalem (Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>Keskin steril makas&nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>Steril forseps</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Thoma hücre sayma odası</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları (Fisherbrand Plastik)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Silindirik Tutucu 15 - 30 gm</td><td>Çalma</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Sitosantrifüj</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Steril gazlı bez süngerler</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

fare c1498 cep hattı ve İlişkili lösemi fare modeli karakterizasyonu için detaylı protokolü

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

1941 Bu enjeksiyonlar, akut lösemi gelişme olmasına neden olduğundan, genetik olarak özdeş ya konjenik farelere C1498 hücrelerinin damar içi enjeksiyon yapılmıştır. Bununla birlikte, bu hastalığın doğasına, literatürde iyi belgelenmiştir edilmemiştir. Burada, in vitro C1498 hücreleri karakterize etmek için in vivo olarak uyarılan lösemi doğasını belirlemek için bir teknik protokol sağlar. Bu prosedürün ilk bölümü hematopoietik soy ve kültür C1498 hücrelerin farklılaşma aşamasının belirlenmesinde odaklanmıştır. Bunu elde etmek için, çok parametre akış sitometrik boyama hematopoietik hücre markörleri tespit etmek için kullanılır. İmmünofloresan mikroskopi, sitokimyasal ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama sonra sırasıyla, miyeloperoksidaz ifadesini, esteraz ve hücresel morfoloji aktivitesini değerlendirmek için yapılır. Bu protokolün ikinci bölümü indüklenir lösemi hastalığını anlatan adamıştırin vivo. Ikinci kan lösemik ve içsel hücre frekansları saptanmasıyla elde edilebilir sitometrisi belirli bir lekeleme kullanılarak ve akış hematopoietik organların (örneğin, kemik iliği ve dalak) ve non-lenfoid dokular (örneğin, karaciğer ve akciğer) analiz eder. lösemi doğası sonra kemik iliğindeki özel esteraz için Mayıs-Grünwald Giemsa boyama ve boyama kullanılarak teyit edilmiştir. Burada, aynı yaştaki C1498- ve PBS ile enjekte edilmiş farelerde, bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları sunulmaktadır.

C1498 fare modeli karakterize etmek için, iki büyük adımlarla ilerledi. İlk olarak, C1498 hücreleri in vitro olarak bunların hematopoietik kökenli ve olgunlaşma aşamasına (Şekil 1) belirlenmesi için karakterize edildi. Bu hücreler daha sonra konjenik farelere enjekte edildi ve indüklenen lösemik hastalığın niteliği, farklı özellikleri belirlemek için değerlendirilmiştir: lösemik hücre infiltrasyonu, bunların fenotip, kemik iliğinde hematopoietik hücrelerin bir miktarının (olgun ve progenitorlar / ön), frekans C1498 hücreleri ve kan olgun hematopoietik hücrelerin ve organ şişme değerlendirilmesi (dalak, karaciğer ve akciğer) ve hücresel bileşimin. In vitro C1498 hücresi fenotipleri karakterize etmek için, hücreler, hematopoietik öncüler ve olgun hücreleri (Tablo 1) ile ifade edilir moleküllerine karşı yöneltilen antikorlar ile etiketlenir ve sonuçlar akış cytomet kullanılarak analiz edilmiştirry. C1498 hücreleri Mac-1 (CD11b / CD18) (~% 7), B220 (&gt;% 25) hücre yüzey ifadesi için pozitiftir ve bunlar CD3ε, T-hücre reseptör (TCR) Vβ zincirleri ve Mac hücre içi ifadesi sergilemiştir 3 (Şekil 2A ve B). hücreler, hücre yüzey markörlerinin Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, pan-NK molekülleri için negatif ve CD4 ve CD8 hücre içi ifadesi için (veriler gösterilmemiştir) . Daha sonra hematopoietik kök hücreler ve progenitorlar (Tablo 1) işaretleri için incelenmiştir. Ayrıca, CD117, CD34, Sca-1, CD150 ve CD16 / 32 hücre yüzey ifadesi için negatif idi (veriler gösterilmemiştir). Bu lösemili hücreler daha sonra yapışma, antijen sunumu ve ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu belirlemek için test edildi. Hücreler yüzey belirteçleri LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), ve H-2D B ifade, CD80, CD86 ve CD274 (veriler gösterilmemiştir) MHC sınıf II negatif idi. C1498 hücreleri, Therefore miyeloid (Mac-1, Mac-3) ve lenfoid işaretleri (B220, CD3, TCR) ifade edilmektedir. daha iyi hematopoetik soy karakterize etmek için myeloperoksidaz ifade immünofloresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Tüm hücreleri onların miyeloid kökeni (Şekil 3A) doğrulandı miyeloperoksidaz, pozitif idi. Hücrelerin büyük bir kısmı, aynı zamanda α-naftil butirat esteraz (Şekil 3B, sol panel) için pozitif boyandı, ve bazıları naftol AS-D kloroasetat esteraz (siyah oklar) (Şekil 3B, sağ panel) için boyandı. Sonuçlar hücrelerin monositik ve granülositik hücrelerin karışımları ihtiva göstermektedir. Mayıs-Grünwald Giemsa boyama yapıldıktan sonra, C1498 hücreleri, yüksek Nucleo-sitoplazmik oranı ile çekirdeğinde 3 ila 5 nükleol, perinükleer halo, çok sayıda vakuoller ve bazofilik sitoplazma (Şekil 3C bir patlama şeklinde bir yapıya görüntülemek için gözlendi ). thUS, C1498 hücre çizgisi monoblastlardan ve miyeloblast oluşmaktadır. C1498 hücreleri (CD45.2 +), daha sonra damar içine CD45.1 + farelere enjekte edildi. fareler hücreleri enjekte edildi 17 ila 19 gün sonra yenik düştü. hastalığın öldü önce lösemi türü analiz edilebilir, böylece bu fareler kurban edildi. PBS enjekte edildi Kontrol fareleri, karşılaştırma için, aynı zaman noktalarında analiz edilmiştir. C1498 hücre enjekte edilen fareler May-Grünwald Giemsa lekeleme (Şekil 4A) yapıldı sonra hücrelerin yüksek benzeri bir görünüm ile gösterildiği gibi, kemik iliği içine C1498 hücrelerinin yoğun infiltrasyonu gösterilir. Onlar da akut miyelomonositik lösemi özelliğidir monoblastik ve miyeloblastik hücrelerin birikimini gösteren, onların monosit ve granülositik fenotipleri (Şekil 4B ve C) korudu. dmedüller hematopoetik hücreler sayılar, lösemik hücreler işgali, CD45.2 + C1498 hücreleri, B lenfositik, monositik ve (ataları, öncüleri ve olgun hücreler dahil) granülositik nüfus aşağıdaki düşüktü immunofluorescent boyama ve sitometri analizi çok parametrik akışını kullanarak ölçüldü olmadığını etermine. Lösemili hücrelerin hematopoietik hücrelerin% 36 16 temsil (veriler gösterilmemiştir). diğer hücre tipi tüm granülositik hücrelerin ortalama 3 kat ortalama olarak 4 kat, B hücresi alt-gruplar için ortalama 5-kat (PBS enjekte edilmiş farelerde daha C1498-enjekte edilmiş farelerde önemli ölçüde daha düşük sayıda mevcuttu C monositik alt-gruplar için) (Şekil 5A). Lösemi ve kontrol fare kan örneklerinde tek çekirdekli hücrelerin frekanslarının bir araştırma da lenfositler (Şekil 6A) arasında benzer bir yüzdesi, ancak monositik daha yüksek bir frekans ihtiva ettiğini gösterdive lösemi hücreleri. Bu özellikler, akut miyelomonositik lösemi 11 (Şekil 6B) temsil etmektedir. Akut miyelomonositik lösemi 12 diğer özellikleri arasında, C1498-enjekte edilen fareler şişmiş karaciğerleri (hepatomegali), akciğer ve dalak (splenomegali) (Şekil 7A) ile sunulmaktadır. CD45.2 + C1498 hücrelerin çeşitli frekanslar immünofloresan boyama ile bu organlarda tespit ve analiz (Şekil 7B) akış sitometrisi edildi. Splenomegali sızmış monositlerin yüksek sayıda kaynaklanabilir, biz de dalak nüfus oranlarını tahmin. B lenfosit, monositik hücreler ve granülositik hücre fraksiyonlarının sayılar 2 kat ortalama, önemli ölçüde daha büyük olan, 2.5 kat, 3 kat, sırasıyla kontrol dalak (Şekil 7C) göre lösemi dalaklarında. İnce sayfa = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> In vitro kültürlü C1498 Cep Hatları ve Akut Lösemi in vivo Tanımlar Karakterizasyonu için Kurma Protokolün. Hematopoetik soy ve doku kültüre C1498 hücrelerinin farklılaşma aşamasında Şekil 1. şematik Temsil ilk belirlendi. C1498 Hücreler daha sonra, akut lösemi gelişiminin uyarılması için konjenik farelere enjekte edildi. kemik iliği, periferik kan, dalak, karaciğer ve akciğer dokularında izolasyonu C1498 hücreleri infiltrasyonu sonra frekansları, fenotipleri ve morfolojik değişikliklerini saptamak amacıyla yapılmıştır. IV: Damar MGG:. Mayıs-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> reklam / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; In vitro kültür. Nokta diyagramları ve hücre yüzeyi (A), ve hücre içi (B) histogramları sitometrisi Örnek akış sonra C1498 Hücreler Şekil 2. fenotipik analizi hematopoetik olgun hücre farklılaşması ile ilişkili moleküller gösterilmiştir C1498 eksprese. C1498 hücreler, hücre yüzeyi CD11b, CD18 ve B220 işaretleri ya da bunların izotip kontrolleri için spesifik olan floresan antikorlar kullanılarak kültürler hasat yıkandı ve etiketlenmiştir. hücre içi boyama için, hücreler, sabit geçirgenleştirildi ve Mac-3, CD3ε karşı antikorlar ve TCR (T hücre reseptörü) Vβ zincirli ya da izotip kontrolleri ortak bir epitop ile etiketlenmiştir. Analizler, canlı hücreleri ile yolluk kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Şekil 3. Fonksiyonel ve Kültür C1498 Hücrelerinin Morfolojik Karakterizasyonu. C1498 hücre kültürlerinden hasat edilir ve mikroskopi için slaytlar üzerinde santrifüjlenmiştir. (A), miyeloperoksidaz ifadesi için boyama immünofloresan kullanılarak gerçekleştirildi. (B) Sitokimyasal reaksiyonlar α-naftil butirat esteraz (BOU) ve naftol AS-D kloroasetat esteraz analiz etmek için kullanıldı (CAE) C1498 hücreleri faaliyetleri. Hücreler, kahverengi, kırmızı, mor-geniş, sitoplazmik granüller sırasıyla gözlenmiştir her etiket için pozitif olarak kabul edilmiştir. C1498 hücrelerinin (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) boyama. Her boyama deney için, mikroskop objektif büyütme gösterilir. Her bir görüntü, üç ayrı deneyi temsil etmektedir.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Şekil 4. PBS ve Kemik İliği morfolojileri Fare C1498 enjekte. Kemik iliği hücreleri PBS ve C1498 hücre enjekte edilen farelerin izole ve mikroskopi için slaytlar üzerine santrifüj edildi. (A) Mayıs-Grünwald Giemsa (MGG) boyama. (B ) α-naftil bütirat esteraz (NBE) ve kloroasetat esteraz (CAE) işlevleri sitokimya kullanılarak değerlendirildi AS-D (C) naftol. Panel A&#39;da, bant (olgunlaşmamış) veya bölümlenmiş (olgun) nötrofiller PBS enjekte edilmiş farelerde daha C1498-enjekte edilen farelerin kemik iliği daha az görünür. Panel B, ve C kontrol kemik iliğinde görülen sayılar göre lösemi kemik iliği monositik ve granülositik hücrelerin birikimi olduğunu gösterir. Herşeymikroskopik analizler 100X büyütme objektif kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Şekil 5. PBS ve Medüller Populasyonlarının Kantitatif Analiz Fare C1498 enjekte. Kemik iliği hücreleri PBS ve C1498 hücre enjekte edilen farelerin izole ve hücre sayımı yapıldı sonra tahmin edilmiştir. Farklı hücre popülasyonlarının frekansları immün ve sitometri analizi canlı hücre kapı akış sonra belirlenmiştir. (A), B hücresi alt-gruplar B lenfositler (B), granülositik hücrelerin olgun pro-B hücreleri kademeli olarak CD19 + B220 + hücrelerinin dahil öncüleri bir yer ve CD11b + Ly6G + soy, - CD3. CD115 + ve monosit aşamalarını olgun atası hücreleri dahil - nd olgunlaşmamış ve olgun granülositler (C) monositik alt kümeleri CD3 olarak tanımlanmıştır. n = 7 fare / grup, ve veri = ortalama ± SEM gösteren histogramlar olarak sunulmaktadır. *** P &lt;0.0001 ve ** p &lt;0.01, PBS ve C1498 enjekte fareler karşılaştıran Student en t testi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> PBS ve Mononükleer Hücre Alt Grupları Şekil 6. Kan Analiz fareler C1498 enjekte. Sırasıyla, PBS ve C1498 CD3 + ve B220 + hücrelerinin olarak tanımlanan (a) T ve B limfosit yüzdeleri, dot sitometrisi lekeleri Örnek akış hücresi enjekte. ve CD115 + LY6C yüksek hücre - fareler (B) C1498 lösemik ve kontrol monositik hücre frekansları (PBS) farenin CD115 + LY6C analiz edilmesi ile belirlenmiştir. Analiz canlı hücreleri yolluk gerçekleştirildi. Lösemi ve kontrol fareleri karşılaştırmak için, C1498 hücreleri hariç tutulmuştur + CD45.2. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Lösemi ve Kontrol Farelerde Dalak Populasyonlarının Şekil 7. tahmini. (A), lösemi farelerde şişen, karaciğer, akciğer ve dalak Örnek fotoğraf kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında. Dalaklar, doku bozulması, aşağıdaki toplanır ve tartılır ve splenositler sayıldı. (B) Histogram fark lösemik hücre frekansları temsil edenerent organları immün CD45.2 + hücreleri için yapıldı ve sonuçlar flow sitometri kullanılarak analiz edildikten sonra. (C) dalak B, immün sonra granülositik ve monositik hücre sayıları tahminleri ve analiz yolluk akım sitometri canlı CD19 + B220 belirlemek için yapılmıştır + CD3 - CD11b + Ly6G + CD3 - CD11b + Ly6C - ve CD3 - CD11 b + Ly6C yüksek hücreler. akciğerler, dalak ve karaciğerleri için gösterilen ölçek çubukları 1 cm göstermektedir. .. 5 = - 8 fare / grup, ve veri ortalama ± SEM olarak histogramlar temsil edilir * p &lt;0.05; ** p = 0.0033, PBS ve karşılaştırma Student t testi en C1498-enjekte edilen fareler <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">, lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> hücre Tipi </td><td> Zar veya hücre içi moleküller </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Öncüleri ve Olgun hücreleri </td><td></td></tr><tr><td> NK hücreleri </td><td> NK1.1 + pan-NK + </td></tr><tr><td> NKT hücreleri </td><td> NK1.1 + pan-NK + TCR Vbeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> T lenfositleri </td><td> TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> B hücreleri öncüleri ve B lenfositleri </td><td> B220 + CD19 +, CD21 / + 35 </td></tr><tr><td> granülositik öncüleri ve granülositler </td><td> Ly6G + Mac-1 + CD11b + </td></tr><tr><td> monositik ön-maddeleri ve monosit / makrofajlar </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / + 35, CD115 + Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> atalarıdır </td><td></td></tr><tr><td> multipotent atalarıdır </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin CD150-) </td></tr><tr><td> lenfoid hazırlanmış multipotent progenitörler </td><td> CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> ortak lenfoid atalarıdır </td><td> CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> Ortak miyeloid atalarıdır </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td> granülosit-makrofaj progenitörler </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td> megakaryosit-eritroid atalarıdır </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematopoetik kök hücreler </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin CD34) </td></tr></tbody></table> Tablo Hematopoetik hücre soylarının ve Farklılaşma 1. İşaretleyiciler. CD: farklılaşma küme; Lin: Olgun hücrelerin belirteçleri; lo:Düşük ifadesi; hi: yüksek ifade; int: ara ifade; NK: doğal öldürücü hücreler; TCR: T-hücresi reseptörü.

Bu yazıda, in vitro ve enjeksiyondan sonra farelerde akut lösemide C1498 hücre kültürlerinin karakterize etmek için kullanılabilen bir teknik prosedürü sağlar. Fenotipik ve fonksiyonel analizler flow sitometri, immünofloresan mikroskopi, histokimya ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama kullanılarak gerçekleştirilir.

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Bu prosedürün genel amacı, Murine C1498 hücrelerini ve farelere intravenöz enjeksiyon sonrası bu hücrelerin indüklediği akut lösemiyi karakterize etmektir. Bu prosedürün temel avantajı, C1498 hücrelerinin enjeksiyonu sonrası indüklenen fare miyelomonositik lösemisinin, insan hastalığının birçok özelliğini sergilemesidir. Bu hayvan modeli, Hematoloji alanındaki lösemi gelişimine ve immün yetmezliğe yol açan mekanizmalar nelerdir gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu hayvan modelinin önemi, yeni kemoterapötik ve immünoterapötik ajanların test edilmesini kolaylaştırdığı için lösemi tedavisine kadar uzanmaktadır. Beş ila altı haftalık dişi konjenik C57 black 6 fareyi steril bir laminar akış kabinine aktararak başlayın. Ardından, hayvanı bir sabitleyiciye yerleştirin.Ardından, 29 gauge iğne takılmış bir mililitrelik bir şırıngaya 100 µL hücre yükleyin. Distal ucun kuyruk kısmını kavrayın ve kuyruk derisini %70 etanolle ıslatılmış bir gazlı bezle dezenfekte edin. 1 × 10⁶ hücreyi bir lateral kuyruk venine yavaşça enjekte ederek işleme devam edin.Tüm hücreler verildiğinde iğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesine steril gazlı bezle hafifçe bastırın. Ardından hayvanı kafesine geri koyun ve sonraki birkaç hafta boyunca dikkatle izleyin. 17 ila 19 gün sonra, anestezi altındaki lösemili hayvanın gözünün medial kantusuna bir kapiler tüp yerleştirin.Orbital sinüsten kapiler tüpe 100 ila 200 µL kan çekilecektir. Tüpü çıkarın ve göz üzerine steril bir gazlı bez sünger nazikçe uygulayarak kanamayı kontrol altına alın. Ardından, kanı bir EDTA tüpüne aktarın ve mononükleer hücre izolasyonuna kadar tüpü buz üzerinde saklayın.Kan mononükleer hücrelerini izole etmek için öncelikle final hacmi 500 µL olacak şekilde 1 mM EDTA eklenmiş PBS ilave edin. Ardından, örneği bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Son olarak, katmanların karışmamasına dikkat ederek, 30 gauge iğne uçlu 1 mL'lik bir şırınga yardımıyla 500 µL ayırma solüsyonunu dikkatlice kanın altına katman olarak ekleyin.Hücreleri santrifüjleme yoluyla ayırın ve opak beyaz mononükleer hücre tabakasını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından, immün hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri santrifüjleyin ve pelletini, boyama ve akış sitometrisi ile analiz için 600 microliters FACS tamponu içerisinde yeniden süspande edin.Kemik iliğini izole etmek için fareyi plastik bir tahtanın üzerine sırtüstü yerleştirin ve hayvanın uzuvlarını sabitleyin. Hayvanı %70 etanol ile dezenfekte edin. Ardından, her bacağı eklemin üzerindeki femur kısmından kesin ve tibiayı femurden ayırmak için hafifçe çekin.Kemiklerden deri ve kasları çıkarmak için pens ve makas kullanın ve kemikleri buz üzerindeki bir petri kabına aktarın. Ekstremiteleri çıkarmak için makas kullanın. Ardından, beş mililitre soğuk PBS içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya takılı 26 gauge iğneyi her seferinde bir kemiğin ucuna yerleştirin ve kemik iliğini kabın içine yıkayarak boşaltın.Kemik iliği hücrelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu iğne ucundan birkaç kez geçirin. Ardından, tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri yeni bir 70 mikronluk filtreden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Hücreleri santrifüjleyin ve peleti iki mililitre lizis tamponu içinde yeniden süspande edin.Tüpü hemen 50 milliliters kadar soğuk PBS ile doldurun ve hücreleri santrifüjleyin. Ardından, kemik iliği peletini soğuk FACS tamponunda 1 × 10⁶ hücre/milliliter konsantrasyonda yeniden süspande edin. Kemik iliği hücrelerini boyamaya hazırlamak için öncelikle, lamları önceden eklenmiş filtre kartlı tek kullanımlık haznelere yerleştirin ve hazneleri bir sitosantrifüje yerleştirin.Her bir filtre kartı bölmesine 100 µL FACS tamponu ekleyin ve lamları kısa süreliğine santrifüjleyin. Santrifüj işleminin sonunda, her bölmeye 100 µL hücre ekleyin ve hücreleri santrifüjleyin. Ardından, havada kurutmak için lamları bölmelerden dikkatlice çıkarın.Kemik iliği hücrelerini boyamak için lamları, May-Grunwald çözeltisi içeren bir coplin kavanozunda beş dakika bekletin. Ardından, lamları pH değeri 6.8 olan bir tampon çözelti kavanozuna bir dakika boyunca aktarın. Sonrasında, lamları 10 dakika boyunca Giemsa R çözeltisine aktarın.Ardından pH nötr su ile 10 saniyelik bir yıkama yapın. Yıkamadan sonra, lamların havada kurumasına izin verin ve her örneğe bir damla kapatma medyumu uygulayın. Daha sonra, bir lamellenin bir kenarını lamın üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını gidermek için hafifçe bastırarak lamelleyi hücrelerin üzerine dikkatlice indirin.Kontrol hayvanlarla karşılaştırıldığında, C1498 hücresi enjekte edilen hayvanların kemik iliğinde, hücrelerin blast benzeri görünümünden anlaşıldığı üzere, masif bir C1498 hücresi infiltrasyonu görülmektedir. Kemik iliğine infiltre olan C1498 hücreleri, sırasıyla monoblastik ve myeloblastik hücrelerin göstergesi olan monositik ve granülositik fenotipler sergilemektedir ki bu durum akut myelomonositik löseminin karakteristik özelliğidir. C1498 enjekte edilen farelerin kan örneklerindeki mononükleer hücre frekanslarının akış sitometrik analizi, toplam beyaz kan hücresi popülasyonunun yaklaşık dörtte birinin lösemik hücrelerden oluştuğunu göstermektedir.Kontrol grubu ile C1498 enjekte edilen hayvanlar arasında T ve B lenfosit frekansları benzerdir. Bununla birlikte, akut miyelomonositik löseminin bir özelliği olarak, C1498 enjekte edilen farelerde monosit frekanslarının daha yüksek seviyelerde olduğu gözlemlenir. Sitokimya ve May-Grunwald Giemsa prosedürleri uygulanırken uygun pH değerlerinin, sıcaklıkların ve inkübasyon sürelerinin korunduğundan emin olmak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, akut miyelomonositik löseminin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, Hematoloji alanındaki araştırmacıların diğer hayvan modellerinde spontan ve indüklenmiş akut löseminin doğasını keşfetmesinin yolunu açmıştır.

a-detailed-protocol-for-characterizing-murine-c1498-cell-line-its

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) birçok metastatik kanser prognostik bulunmaktadır. Bu el yazması altın standart CellSearch sistemi (CSS) CTC sayım platformu ve golleri ortak yanlış sınıflandırma hatalar açıklanır. Buna ek olarak, iki uyarlanmış protokolleri bu teknolojiyi kullanarak metastaz klinik öncesi fare modellerinde kapalı zaman eğrilerinin ve CTC numaralandırma kullanıcı tanımlı işaretleyici karakterizasyonu için tarif edilmiştir.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.

Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Protokol, indüksiyon kemoterapisine yanıtın dinamiklerine dayalı olarak akut lenfoblastik löseminin nüksetmesine neden olan bir fare modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli

Öğrenin, C1498 hücreleri ve indükledikleri akut lösemi için fare modeli karakterizasyonunu. Akut miyelomonositik lösemi mekanizmalarını anlamak ve yeni tedavileri test etmek için akış sitometrisi ve sitokimya kullanın.

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

Daha fazla video keşfet