Name: Imagens de cálcio na Drosophila At Activation Egg (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a visualizar ondas de cálcio durante a ativação do ovo em Drosophila melanogaster usando microscopia de fluorescência. Este método ex vivo permite alta resolução espacial para estudar dinâmica do cálcio em biologia do desenvolvimento.

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Somos gratos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya para a assistência durante a preparação deste manuscrito; Mariana Wolfner para discussões sobre a ativação do ovo; Matt Wayland para suporte de imagem; e Nan Hu para apoio geral em laboratório. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Cambridge, ISSF para TTW [número de concessão 097.814].

Nota: Realizar todas as medidas à temperatura ambiente, salvo indicação contrária. 1. Preparação para Dissection Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com E. gavis, Universidade de Princeton &amp; Weil et. al. 18. Execute os seguintes passos dois dias antes de imagem. <ol><li> Aqui fly um frasco contendo aproximadamente 10 ml de comida sólida e adicionar uma pequena quantidade de fermento seco para um canto, inferior a 1 g é suficiente. Nota: Para obter informações sobre frascos de voar ou de alimentos ver &#39;Drosophila Manutenção&#39; 19. </li><li> Adicionar 1 - 3 gotas de água para hidratar a levedura. </li><li> Definir o frasco de lado em um ângulo de 45 ° e permitir 3-5 min para a levedura para assumir a água. </li><li> Enquanto a levedura é a absorção de água, seleccionar uma garrafa de moscas que expressam GCaMP5 MYR UASt- 20 impulsionado por banheira-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que surgiram recentemente (um myristoyforma lada do GCaMP5 foi escolhido para fornecer um sinal de alta-ruído através de amarrar o GECI à membrana dentro do ovo). </li><li> Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO2. Certifique-se de manter a garrafa invertida de modo a não perder moscas na comida húmida. </li><li> Dica as moscas anestesiados em uma almofada de CO 2 e tipo 10 - 15 mulheres e 5 homens usando um pincel sob um microscópio de dissecação. Nota: É padrão para incluir machos para fornecer fêmeas saudáveis ​​para dissecção. </li><li> Quando o frasco do passo 1.3 está pronto, adicione as moscas selecionados para o frasco. Tome cuidado para manter a horizontal frasco até que as moscas se tornar ativo. </li><li> Colocar o frasco a 25 ° C durante aproximadamente 36 h. </li><li> Retornar as moscas remanescentes do CO 2 pad para a garrafa ou descarte. </li></ol> 2. Dissecting Drosophila Ovário Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com Weil et. ai. <s-se&gt; 18. <ol><li> Após 36 h, anestesiar as moscas do frasco yeasted com CO 2. </li><li> Uma vez que as moscas dentro do frasco são anestesiados ponta-los para a almofada de CO 2 a ser classificados com um pincel sob um microscópio de dissecação. </li><li> Selecione uma fêmea. </li><li> Isolar os dois ovários de fêmea. Para protocolo detalhado completo ver Weil et. al. 18. Em suma: <ol><li> Colocar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados oxigenado (série 95) em um n ° s 1.5, 22 x 40 milímetros lamela. </li><li> Agarrar a fêmea com uma pinça na anterior do abdome. </li><li> Segurando a fêmea sob o microscópio de dissecação, use o segundo conjunto de pinças para remover suavemente a parte posterior da fêmea. </li><li> Limpe o tecido posterior do segundo fórceps. </li><li> Espremer na cavidade abdominal com a segunda pinça do anterior para o posterior do abdómen. Os dois ovários opaco deve ficar para a pinça quando fora da FEMAle. </li><li> Toque nos ovários no óleo. </li><li> Remover qualquer tecido do fórceps por limpando os fórceps. </li><li> Repita essas etapas (2.4.1 - 2.4.7) para obter três lamelas, cada um contendo os ovários de uma mosca. </li></ol></li></ol> 3. Isolando Individual óvulos maduros <ol><li> Sob um microscópio de dissecação padrão com a ampliação definido para 4X, na primeira lamela a partir do passo 2.4, separar os dois ovários, rasgando a tuba uterina. </li><li> Introduzir um par de fórceps fechadas para o centro de um único ovário, tomando cuidado para não perfurar quaisquer câmaras de ovo. </li><li> Insira uma sonda de dissecação padrão para o centro do ovário ao lado das pinças fechadas. </li><li> Suavemente arrastar a sonda de dissecação através do ovário para o pólo posterior, onde os óvulos maduros (fase 14 câmaras de ovo) estão localizados. </li><li> Repita os passos 3.1 - 3.4 2-5 vezes, dependendo do tamanho do ovário e do número de ovos. Nota: A adição de CO 2 </sub&gt; normalmente provoca a deposição de um único ovo que aparecerá maior com apêndices dorsais elevado que os ovos depositados previamente. Este ovo deve ser descartado para a imagem latente, uma vez que já foi activado dentro da fêmea. Nota: óvulos maduros são susceptíveis de separar facilmente a partir de tecido conjuntivo de ovário. </li><li> Se não houver óvulos maduros são visíveis fora do ovário, continue suavemente provocando com a sonda de dissecação. </li><li> Uma vez que os ovos maduros são visíveis na lamela fora do ovário, manobrar 3-5 numa linha no centro da lamela. Nota: Para obter os melhores resultados, a sonda de correr suavemente ao longo do lado dos ovos. Nota: Evite puxando os apêndices dorsais, pois isso pode danificar o óvulo. Nota: Dependendo do futuro imaging set-up, alinhe os ovos cerca de 200 mm além perpendicular à lamela para a área máxima de imagem. </li><li> Uma vez alinhados, remover o resto do tecido do ovário, arrastando-a para longe dos ovos alinhadas utilizando o forceps. </li><li> Retire o excesso de óleo, esfregando com o canto de limpar um médico. Tenha cuidado para não tocar os ovos maduros com o médico limpe ovos, como maduras que são contactadas serão perdidos. </li><li> Desenhar uma cruz sobre a lamela com um marcador para simplificar a colocar a amostra sob o microscópio. </li><li> Defina a lamela em um lugar seguro e deixar as câmaras de ovos preparados na lamela para descansar por 5 - 10 min. Isso permite que o ovo se estabelecer no óleo. As amostras podem ser utilizados até 1 h após a dissecação. </li><li> Repita os passos 3,1-3,11 para o resto das lamelas com ovários sobre eles. </li></ol> 4. Preparar for Imaging <ol><li> Traga tampão de activação preparado para 15 temperatura ambiente. Nota: tampão de activação é um tampão hipotónico: 3,3 mM de NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5% de polietileno glicol 8000, CaCl2 2 mM, levada a pH 6,4 com uma mistura 1: 5 proporção de NaOH: KOH.Para mais informações ver Mahowald, 1983 15. Alíquotas de tampão de activação pode ser armazenado a -20 ° C durante meses e a 4 ° C durante até 2 semanas. </li><li> transportar cuidadosamente lamelas preparados, tampão de activação e pipetas de vidro para a instalação de imagem. Nota: Uma de campo amplo, confocal, de disco rotativo ou folha microscópio de luz pode ser utilizado. Recomendamos o uso de um microscópio invertido. Os resultados representativos foram obtidos utilizando um microscópio confocal. </li><li> Um objectivo adequado para imagiologia de todo o óvulo maduro deve ser escolhida (aqui: 20X 0,7 NA). </li><li> Montar a primeira lamela preparado para o palco microscópio. Tome cuidado para não quebrar as lamelas no palco. </li><li> Qualitativamente selecionar um campo de visão com uma câmara de óvulo maduro para a ativação. Do não de imagem perfurada câmaras de ovo ou aqueles com formação de bolhas na membrana. Nota: Para obter etapas 4.6 - 4.7, comandos de software irá variar dependendo do microscópio e fabricante. </li><li> Set parágrafo imagingmetros para a excitação padrão GFP (488 nm) e emissão (500-580 nm). Também configurar uma vista de campo brilhante, a fim de visualizar e orientar o óvulo maduro e óleo de deslocados. </li><li> Seleccionar o menor plano z em que os ovos maduros são visíveis e definir um Z-pilha completa para ser levado para 40 um a cerca de 2 mM por passo. Defina os parâmetros para que haja nenhum atraso entre a aquisição Z-stack. Definir a série de tempo para capturar cerca de 30 min. </li></ol> 5. Activação de imagem Ex Vivo ovo <ol><li> Comece a captura da imagem. </li><li> Espere por 1 - 2 completos Z-stacks a serem adquiridos. Isto mostra o óvulo maduro antes da activação. </li><li> Retirar cerca de 300 ul de tampão de activação para uma pipeta de vidro. </li><li> Posicionando a ponta da pipeta de vidro contendo tampão de ativação em um ângulo de 45 ° acima da lamela, mova lentamente a pipeta no caminho do feixe até que esteja diretamente acima do óvulo maduro que está sendo trabalhada. A pipeta de vidro deveser de 1 - 2 cm acima do óleo. </li><li> Adicionar 1 - 2 gotas de tampão de activação em menos de 5 segundos a partir da pipeta de vidro. Isto deve deslocar o óleo. Evitar a adição de tampão de activação de excesso ou tocar no ovo com a pipeta de vidro, uma vez que pode causar o deslocamento do óvulo maduro. Tome cuidado para não tocar a lamela com a pipeta, pois isso pode causar uma mudança no plano ou bolhas de ar focais a se formar no óleo de imersão entre o objetivo e lamela. </li><li> Embora a adição de tampão de activação durante a aquisição de imagem, verificar o canal de campo brilhante para assegurar que o óleo tenha sido deslocado pelo tampão de activação. Nota: Isto irá aparecem pela primeira vez como uma sombra devido à pipeta quebra do caminho do feixe, mas também irá resultar no aparecimento de gotas de óleo pequenas. Algumas gotas de óleo pode permanecer associado com o óvulo maduro que irá afectar os resultados experimentais e a qualidade da imagem. </li><li> Se o óleo não é deslocada a partir da adição inicial de tampão de activação de repetir os passos 5,4-5.6. </li><li> Uma vez que o óleo é deslocado com sucesso, permitem que a série de tempo para ser executado até a conclusão. Nota: Devido ao inchaço dos oócitos em ativação, algumas câmaras de ovo irá mover drasticamente fora do plano focal ou campo de visão após a adição de tampão de activação. Nesta situação, pare a aquisição e montagem da próxima lamela. </li><li> Depois da sequência de imagem concluiu aquisição, salvar os dados. </li></ol> 6. Pós-aquisição de Processamento de Imagem <ol><li> Abra o conjunto de dados usando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou software de processamento de imagem equivalente, e selecione os arquivos relevantes para a análise. </li><li> Para construir uma projeção dos dados adquiridos selecione: Imagem&gt; Pilhas&gt; Z-projeto. </li><li> Selecione um começo Z-slice e uma Z-slice parada, geralmente toda a seção. Selecione um tipo de projeção, normalmente definido como &#39;Max intensidade &quot;. Marque a caixa tick &#39;All Time Frames &quot;para aplicar as configurações selecionadas para toda a série. </li><li> E semais de um canal fluorescente foi fotografada, use a ferramenta Canais para permitir o movimento entre as cores, fazer um composto, ou fazer a escala de cinza da imagem. Selecione Imagem&gt; Colors&gt; Canais ferramenta. </li><li> Para ajustar o brilho eo contraste da imagem, selecione Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast. </li><li> Para exportar uma única imagem, mover controle deslizante escala de tempo para o quadro relevante e selecione Arquivo&gt; Salvar como&gt; JPEG ou qualquer formato preferido. </li><li> Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. Nota A taxa de quadros a partir do software de imagem será obrigado a dar uma data e hora na imagem. </li><li> Para exportar a série temporal como um filme selecione: File&gt; Save As&gt; AVI, em seguida, selecione a taxa de quadros (~ 7 quadros por segundo). </li><li> Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. </li><li> Para salvar o arquivo no formato ajustado Fiji, selecione Arquivo&gt; Salvar. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

O primeiro passo crítico neste protocolo é isolar os ovos maduros sem danos. Isso pode ser conseguido por manobras gentílicas dos ovos com a sonda de dissecação. A prática permitirá que essa manipulação seja executada sem danificar os ovos. Um segundo passo crucial é evitar a perda da amostra quando o tampão de ativação é aplicado ao ovo maduro em óleo. A aplicação do tampão de ativação deve ser feita lentamente e sem contato com a lamínula. Esta etapa pode ser desafiadora se a configuração do microscópio não permitir um acesso fácil à amostra. É aconselhável mover as partes axilares do microscópio, como uma incubadora de temperatura. 
Modificações neste protocolo podem ser feitas para visualizar outros fatores marcados com fluorescência, em vez de Ca2+ na ativação do ovo. De forma mais geral, diferentes estágios de desenvolvimento de Drosophila ou os resultados da adição de um tampão diferente podem ser analisados usando este protocolo. 
A solução de problemas pode ser necessária se as configurações do microscópio não forem ideais para visualizar o sinal da amostra. Isso pode ser alcançado aumentando ou diminuindo a potência do laser, alterando o alcance de captura e ajustando os parâmetros da pilha Z. Outro problema pode ser que os ovos se movam consistentemente para fora do campo de visão após a adição do buffer de ativação. Se isso acontecer regularmente, deixe os ovos maduros se depositarem nas lamínulas por um longo período de tempo, 15 a 20 minutos. Esteja ciente de que o uso de um óleo de viscosidade mais alta alterará o deslocamento do óleo pelo tampão de ativação. 
Esta técnica aqui apresentada é limitada pela distância de trabalho da objetiva, desidratação dos ovos maduros e capacidade de dissecar os ovos maduros sem danos. No entanto, quando comparado aos métodos de imagem in vivo onde o oócito maduro passa pela fêmea adulta e é depositado 13, nosso método permite maior resolução espacial, a opção de manipular fisicamente o óvulo maduro antes da ativação e a capacidade de testar o papel da ativação do óvulo sem fertilização. 
Existem muitas aplicações futuras potenciais dessa técnica, incluindo o teste de construções repórter para componentes celulares na ativação do ovo e a visualização da onda Ca2+ em fundos mutantes 14,24. Juntamente com ferramentas experimentais e genéticas, o ensaio de ativação ex vivo do ovo aqui apresentado permite o estudo do gatilho, propagação e efeitos a jusante da onda Ca2+ universalmente conservada.

Uma alteração na concentração intracelular de Ca 2+ em ovo (oócitos) de activação é um componente conservado de todos os organismos estudados 1,2. Este evento inicia uma vasta gama de processos dependentes de Ca 2+, incluindo retomada do ciclo celular e a tradução de mRNAs armazenados. Devido a esta exigência de Ca 2+, visualizando as alterações transitórias em concentrações intracelulares de Ca 2+ tem sido de interesse chave. Historicamente, foram seleccionados organismos modelo para estudos de activação de ovo com base no tamanho e disponibilidade dos seus ovos. Várias abordagens de visualização têm sido utilizadas para seguir e quantificar as alterações na concentração de Ca2 + intracelular em tais sistemas, incluindo: a aequorina fotoproteï¿½a em medaka peixes 3; Ca 2+ corantes fluorescentes sensíveis, tais como Fura-2 em ouriço-do-mar e hamster 4,5; e cálcio verde-1-dextrano em Xenopus 6. A geração e melhoria de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIS) transformou a capacidade de visualizar de Ca2 + dinâmica in vivo 7. Estas construções genéticas são expressas em tecidos específicos e limitar a necessidade de preparações de tecidos invasivos 8. GCaMPs são uma proteína fluorescente (GFP) classe baseado verde da Gecis que têm sido muito eficaz devido à sua elevada afinidade de Ca2 +, razão e capacidade de sinal-ruído para ser personalizado 9-11. Na presença de Ca2 +, o complexo GCaMP sofre uma série de alterações conformacionais, que começa com a ligação de Ca 2+ para a calmodulina, que resulta em um aumento da intensidade de fluorescência da GFP componente 9. GCaMPs têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre neurônios Drosophila visualize as alterações de cálcio intracelular 12. Os applicati recenteson da tecnologia GCaMP para visualizar Ca 2+ em ovos de Drosophila maduros revelou uma única transiente de Ca2 + onda de activação de ovo 13,14. A onda de Ca2 + pode ser visualizada a baixa ampliação durante a ovulação in vivo 13 ou em maior ampliação usando um ensaio de activação ex vivo 13,14. No ensaio ex vivo, os oócitos maduros individuais são isolados a partir dos ovários e activado usando uma solução hipotónica, referido como tampão de activação, o que foi mostrado para recapitular eventos de activação in vivo, em 15-17. Este ensaio ex vivo permite a visualização de alta resolução fácil da onda de Ca2 +, sob diferentes condições experimentais, incluindo perturbação farmacológica, manipulações físicas e mutantes genéticos. Este artigo demonstra a preparação de ovos de Drosophila maduras para a activação ex vivo e The subsequente microscopia usado para visualizar a onda de Ca2 + utilizando GCaMP. Esta abordagem pode ser utilizada para testar a iniciação e controlo da onda de Ca2 + e a sonda resultados jusante.

<table><tbody><tr><td>Levedura ativa seca</td><td>Fleischman» s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Vários funcionarão</td></tr><tr><td>Lâmpada</td><td>Mircotec Fibra óptica</td><td>MF0-90</td><td>Vários funcionarão</td></tr><tr><td>Toalhetes médicos</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Caneta marcadora</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen universal, preta - disponível na maioria das papelarias. Almofada Superfine Width 0.4 mm</td></tr><tr><td>CO2</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm</td><td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de halocarbono, série 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Distribuidor na Europa:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óleo 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Pode ser usado em vez de óleo de halocarbono, série 95</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Embora essas ferramentas devam estar limpas, não é necessário o uso de uma autoclave, o etanol seria suficiente.</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidro</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>Pipetas Pasteur, vidro, desplugadas, 150 mm de comprimento&nbsp;</td></tr><tr><td>Frasco</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

imagens de cálcio na<em&gt; drosophila</em&gt; at activation egg

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

A ativação do ovo é um processo universal que inclui uma série de eventos para permitir que o óvulo fertilizado complete a meiose e inicie o desenvolvimento embrionário. Um aspecto da ativação do ovo, conservado em todos os organismos examinados, é uma mudança na concentração intracelular de cálcio (Ca2+), muitas vezes denominada 'onda de Ca2+'. Embora a velocidade e o número de oscilações da onda de Ca2+ variem entre as espécies, a mudança no Ca2+ intracelular é fundamental para provocar eventos essenciais para o desenvolvimento embrionário. Essas alterações incluem retomada do ciclo celular, regulação do mRNA, exocitose do grânulo cortical e rearranjo do citoesqueleto.
No ovo maduro de Drosophila, a ativação ocorre no oviduto feminino antes da fertilização, iniciando uma série de eventos dependentes de Ca2+. Aqui apresentamos um protocolo para imagens da onda Ca2+ em Drosophila. Essa abordagem fornece um sistema de modelo manipulável para interrogar o mecanismo da onda Ca2+ e as mudanças a jusante associadas a ela.

Aqui demonstramos como preparar ovos de Drosophila maduros para a activação ex vivo. Ovos expressam um GECI permitir imagens de Ca 2+ dinâmica na activação de ovo e o início do desenvolvimento embrionário (Figura 1). Deve notar-se que, dependendo da GCaMP usado, especificamente a presença de um grupo miristoílo, os resultados podem ter pequenas diferenças qualitativas 13 14. Nós também têm demonstrado um papel para a actina funcional durante a activação do ovo por meio da adição de um inibidor de polimerização de actina, citocalasina D, para o tampão de activação (Figura 2) 14. Um requisito para o citoesqueleto na activação do ovo é conservada. Em C. elegans, após a fertilização, os componentes do citoesqueleto são reorganizados para preparar o embrião de uma célula para a primeira divisão assimétrica 21,22. Em ouriço do mar, a perturbação dos cytoskeleTal re-organização após activação foi mostrado para afectar o ciclo celular, prevenindo a formação do anel 23 contráctil. O papel da actina na mediação de uma onda de Ca2 + e sua função jusante para ativação ovo em Drosophila continua a ser totalmente elucidado. Em Drosophila, o co-visualização da onda do citoesqueleto de actina e de Ca2 + pode ser conseguida utilizando este ensaio de activação ex vivo. Séries temporais de vários canais podem ser adquiridas e dinâmica do Ca2 + intracelular pode ser combinado com mudanças na organização da actina no oócito (Figura 3). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> Figura 1:. A Single Ca 2+ onda em série Drosophila Egg Activation Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 seguindo a umddition de tampão de activação (AH). O aumento no Ca 2+ citoplasmático origina-se no polo posterior (B) e propaga (BF) com uma velocidade média de cerca de 1,5 um / seg. Iniciação da onda é tipicamente observada dentro de 3 minutos da adição de tampão de activação. Após a activação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro retorna aos níveis (G, H) de pré-activação. Veja o filme suplementar 1 (tempo total de 33 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> Figura 2: A adição de citocalasina D da Activação: Tampão perturba Ca2+ Propagação de Ondas. A série da ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 após a adição de tampão de activação contendo / ml concentração final citocalasina D 10 mg (AH). Embora a onda 2+ Ca é iniciada no pólo posterior (A), que é comprometida e não atinge o anterior do ovo (F) (setas brancas indicam a frente da onda). Nenhuma outra Ca 2+ foram observadas alterações ao longo de 30 min). Veja o filme suplementar 2 (total de tempo de 30 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> Figura 3: Co-visualização de actina e Ca 2+ em EAtivação gg em série Drosophila. Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 (ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) após a adição de tampão de activação (AH). O Ca 2+ onda inicia a partir do pólo posterior e recupera como na Figura 1. Actina parece estar mudando ao longo do tempo, as setas brancas (A vs H). A falta de detecção do sinal de Ca2 + no centro do óvulo maduro é devido ao movimento da amostra durante a captura de imagem. Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o cálcio durante a ativação do ovo em Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia do desenvolvimento, como qual é a origem, a dinâmica e os papéis downstream do cálcio na ativação do ovo. As principais vantagens desta técnica são permitir uma resolução espacial mais alta, a manipulação física do ovo maduro antes da ativação e o teste do papel da ativação do ovo sem fertilização.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldade em isolar os óvulos maduros sem danificá-los e em aplicar o tampão de ativação sobre o óvulo maduro sem perder a amostra. Para iniciar este procedimento, ajuste a ampliação do microscópio estereoscópico para 4X. Sobre a primeira lamínula, separe os dois ovários rasgando o oviduto com uma pinça fechada e uma sonda de dissecação, tomando cuidado para não perfurar nenhuma câmara de ovo.Em seguida, insira uma sonda de dissecação padrão no centro do ovário, ao lado da pinça fechada. Arraste suavemente a sonda de dissecação através do ovário, em direção ao polo posterior, onde estão localizados os óvulos maduros. Assim que os óvulos maduros forem visíveis sobre a lamínula, fora do ovário, posicione três a cinco deles em linha no centro.Em seguida, remova o restante do tecido ovariano puxando-o para longe dos óvulos alinhados. Depois, remova o excesso de óleo pressionando com o canto de uma toalha médica. Desenhe uma mira em forma de cruz na lamínula com uma caneta para localizar a amostra sob o microscópio.Depois disso, deixe as câmaras de ovo preparadas sobre a lamínula em repouso por cinco a dez minutos para permitir que os ovos se acomodem no óleo. Leve à instalação de imageamento as lamínulas preparadas, o tampão de ativação em temperatura ambiente e as pipetas de vidro. Selecione uma objetiva adequada para o imageamento do ovo maduro inteiro.Em seguida, monte a primeira lamínula preparada na platina do microscópio. Depois, selecione um campo de visão de uma câmara de ovo madura para ativação. Defina os parâmetros de imagem para excitação e emissão padrão de GFP.Em seguida, configure uma visualização em campo claro para visualizar e orientar o óvulo maduro e o óleo deslocado. Agora, selecione o plano Z mais baixo em que os óvulos maduros são visíveis. E defina uma pilha Z completa para ser adquirida em 40 micrômetros com incrementos de dois micrômetros por passo.Em seguida, configure a série temporal para capturar as imagens durante 30 minutos. Neste procedimento, inicie a captura de imagens e adquira um a dois Z-stacks completos para mostrar o óvulo maduro antes da ativação. Em seguida, aspire aproximadamente 300 microlitros de tampão de ativação para dentro de uma pipeta de vidro.Posicione a ponta da pipeta de vidro contendo o tampão de ativação em um ângulo de 45 graus acima da lamínula e mova lentamente a pipeta até o caminho do feixe, até que esteja diretamente acima do óvulo maduro em observação. Adicione uma a duas gotas de tampão de ativação em menos de cinco segundos, para deslocar o óleo. A adição de uma a duas gotas de tampão de ativação deve ser feita no ângulo correto, suavemente e rapidamente.Enquanto adiciona o tampão de ativação durante a aquisição de imagens, verifique o canal de campo claro para garantir que o óleo foi deslocado. Uma vez que o óleo tenha sido deslocado com sucesso, permita que a série temporal prossiga até a conclusão. Para criar uma projeção dos dados adquiridos, selecione uma fatia Z inicial e uma fatia Z final para toda a seção.Em seguida, selecione um tipo de projeção, por exemplo, intensidade máxima. Depois, marque a caixa de seleção Todos os quadros temporais para aplicar as configurações selecionadas a toda a série. Para ajustar o brilho e o contraste da imagem, selecione Imagem, depois Ajustar e, em seguida, Brilho/Contraste.Para exportar a série temporal como um filme, selecione Arquivo, depois Salvar Como, seguido por AVI. Em seguida, selecione a taxa de quadros. É mostrada aqui a série temporal de um ovo maduro de Drosophila ex vivo expressando um indicador genético de cálcio após a adição do tampão de ativação.O aumento do cálcio citoplasmático se inicia no polo posterior e depois se propaga com uma velocidade média de aproximadamente 1,5 micrômetros por segundo. O início da onda é tipicamente observado dentro de três minutos após a adição do tampão de ativação. Após a ativação, os níveis intracelulares de cálcio do óvulo maduro se recuperam.Em Drosophila, a co-visualização da onda de cálcio e do citoesqueleto de actina pode ser obtida utilizando este ensaio de ativação ex vivo. A actina parece mudar ao longo do tempo, conforme indicado pelas setas brancas. A ausência de detecção do sinal de cálcio no centro do óvulo maduro deve-se ao movimento da amostra durante a captura da imagem.Uma vez dominada, toda esta técnica pode ser realizada em menos de uma hora, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de tomar o tempo necessário ao manipular as câmaras ovulares e ao configurar os parâmetros para a aquisição. Este procedimento pode ser adaptado para visualizar outras proteínas marcadas com fluorescência, organelas ou indicadores de cálcio na ativação do ovo.Isso pode ajudar a responder perguntas sobre a fonte de cálcio e os efeitos downstream.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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