Name: Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Scopri il monitoraggio in tempo reale della chemiotassi nelle cellule HL60 neutrofili-like mediante microfluidica ad alta risoluzione. Questo metodo consente di visualizzare gli eventi di segnalazione durante la migrazione cellulare.

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Questo lavoro è supportato dal fondo intramurale di NIAID, NIH.

<ol><li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila%3A+themes+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+genetics%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente per questo lavoro.

Nel presente studio, mostriamo due esempi di analisi chemiotattica: in primo luogo, il monitoraggio simultaneo di molteplici analisi chemiotattica dal dispositivo di analisi della mobilità delle cellule; e in secondo luogo, la visualizzazione del gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali degli eventi nelle stesse celle in tempo reale di segnalazione. dispositivo di analisi della mobilità cellulare per più analisi chemiotattica simultanei Nel presente studio, abbiamo introdotto un protocollo dettagliato per eseguire più analisi chemiotattica simultanea utilizzando un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule. Questo dispositivo permette di osservare il comportamento chemiotassi cellulare con una lente obiettivo 10X in osservazione in campo chiaro convenzionale. A causa delle caratteristiche di diffusione dominante del flusso di fluido, il dispositivo di analisi della mobilità cellulare genera altamente prevedibili, gradienti stabili e consente fino a sei analisi chemiotattica essere effettuate simultaneamente. I passaggi critici del protocollo sonoavere gradienti affidabili e allineare le celle nella riga terrazza. L&#39;utente deve seguire rigorosamente le istruzioni del produttore per il montaggio titolare e l&#39;iniezione di fattori chemiotattici e cellule. Istruzioni dettagliate sono disponibili anche online. Rispetto ai metodi alternativi chemiotassi 11-13,15, questo dispositivo migliora notevolmente l&#39;affidabilità e l&#39;efficienza di analisi chemiotattica. Quattro formati di mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi in dimensioni di 4, 5, 6, e 8 micron sono disponibili per ospitare diversi tipi e dimensioni di cellule. Abbiamo scoperto che una mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi 4 o 5 micron è adatto per l&#39;HL60 e D. cellule discoideum, che sono circa il 10-15 micron di diametro. Tuttavia, una limitazione è che questo dispositivo non è adatto per tutti i tipi di cellule. Abbiamo avuto poco successo con il saggio chemiotassi dispositivo di analisi della mobilità delle cellule con le cellule Raw267.4. La ragione può essere che le cellule migrano Raw267.4 troppo lentamente. Il tempo necessario per Che efficientemotaxis di cellule Raw267.4 potrebbe essere molto più lungo del tempo di un gradiente viene mantenuta dal dispositivo. Invece, un test di migrazione transwell ha funzionato bene per le cellule Raw267.4 9. Un&#39;altra limitazione è che l&#39;osservazione fluorescente non è possibile con il dispositivo corrente. Una direzione futura è quello di monitorare l&#39;imaging a fluorescenza con ingrandimento maggiore. Questo è possibile con il dispositivo perfezionato analisi della mobilità cellulare, che è dotato di rilevazione fluorescente ed una lente obiettivo 100X. Inoltre, il numero di saggi simultanee è anche aumentata a 12. Tutti questi miglioramenti facilitano la maggiore throughput analisi chemiotattica e l&#39;osservazione delle dinamiche subcellulari nella migrazione delle cellule. Elevata efficienza di trasfezione di cellule HL60 per esprimere la proteina proteina fluorescente-tag cellule HL60 sono una linea cellulare di leucemia dividendo attivamente e crescono in sospensione. Come precedentemente riportato 18-20, cellule HL60 sono resistenti gtrasferimento ene. Sia lipidi e il trasferimento genico elettroporazione sono stati testati, e una maggiore efficienza di trasfezione è stato ottenuto con elettroporazione, come descritto in dettaglio nel capitolo 4. Recupero alta vitalità dopo l&#39;elettroporazione è fondamentale per l&#39;ottenimento di alta efficienza di trasfezione a causa del grave danno che deriva dalla elettroporazione. Successivamente, la gestione accurata e delicata delle cellule sono necessari, soprattutto dopo l&#39;elettroporazione. Tutti i supporti devono essere pre-riscaldato e delicatamente aggiunto alle cellule in tutte le misure dopo l&#39;elettroporazione. È anche fondamentale ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule alla reagente elettroporazione. Per evitare la morte delle cellule, dopo l&#39;elettroporazione, RPMI 1640 medium recupero elettroporazione deve essere aggiunto alle cellule immediatamente. Abbiamo scoperto che il 20% FBS a medio recupero dà un tasso di recupero delle cellule molto superiore al 10% FBS. Dopo l&#39;elettroporazione, incubazione in RPMI medio recupero 1640 elettroporazione per 30 minuti è fondamentale per una maggiore vitalità e trasfezioneefficienza. Per aumentare ulteriormente l&#39;efficienza di trasfezione, abbiamo usato anche 4 mg plasmide DNA per trasfezione, che è quasi la quantità doppia di plasmide consigliato dal produttore. Ci sono due principali limitazioni su elettroporazione trasfezione: la transitorietà della espressione della proteina e il limite di numero di cellule (2 x 10 6 cellule per trasfezione). In cellule indifferenziate, espressione è rilevabile solo durante il primo paio di divisioni cellulari, poiché il vettore plasmidico è diluito metà dopo ogni divisione cellulare. Per Il HL60 differenziate cellule sopravvivono non più di 48 ore. Come risultato, ogni esperimento richiede trasfezioni freschi 6 ore prima dell&#39;esperimento. Il numero di cellule per una elettroporazione solo soddisfa il requisito minimo per tutti i saggi biochimici. Ai fini di uso ripetitivo o grande quantità, si raccomanda vivamente che si stabilisca una linea di cellule HL60 indifferenziata che stabilmente esprime la proteina di interesse WHIch è stato etichettato con una proteina fluorescente da un vettore virale, se un vettore virale è disponibile o può essere costruito.

Le cellule eucariotiche senso e si muovono verso la maggiore concentrazione all&#39;interno di un gradiente chemiotattico, un processo cellulare indicato come chemiotassi. Chemiotassi gioca un ruolo critico in molti processi fisiologici, come l&#39;embriogenesi 1, neurone patterning 2, le metastasi delle cellule tumorali 3, il reclutamento dei neutrofili a siti di infiammazione 4, e lo sviluppo del modello di organismo Dictyostelium discoideum 5. In generale, le cellule eucariotiche senso chemoattractants utilizzando G-proteine ​​recettori accoppiati 5. L&#39;impegno di chemiotattici con questi recettori promuove la dissociazione delle proteine ​​G eterotrimeriche Gα e Gβγ, che a loro volta attivano vie di trasduzione del segnale a valle che infine regolano l&#39;organizzazione spazio-temporale del citoscheletro actina di guidare la migrazione delle cellule 5-9. biologi cellulari stanno sviluppando e migliorando la chemiotassiè metodi per esaminare come recettori accoppiati a proteine ​​g (GPCR) di segnalazione media la migrazione delle cellule dirette. Il saggio della camera o la migrazione transwell Boyden è stato sviluppato nel 1960 da Boyden 10. Il test funziona creando un gradiente di composti chemotattiche tra due pozzetti separati da una membrana microporosa. La sua semplicità e facilità d&#39;uso rendono il saggio chemiotassi più usato fino ad oggi. Tuttavia, il test non consente al processo di migrazione delle cellule da visualizzare. La camera di Zigmond è il primo dispositivo a microfluidi visivo che permette l&#39;imaging chiaro di migrazione delle cellule su un vetrino in una costrizione stretto verso una fonte chemoattrattante 11. Dunn 12 e 13 Insall modificati e migliorati ad alta risoluzione e la capacità di imaging a lungo termine del test chemiotassi camera di Zigmond. A causa delle caratteristiche, altamente prevedibili di diffusione dominante di flusso del fluido, microfluidica è stata fornitura di soluzioni per il prossimo-Generatisu analisi chemiotattica come EZ-TAXIScan (un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule). Con la stabilità del gradiente assicurato, il dispositivo consente sei chemiotassi test da effettuare contemporaneamente (Figura 1A). In contrasto con i gradienti direzionalmente fissi generati nei vari saggi camera sopra, il saggio ago o micropipetta sviluppato da Guenther Gerisch genera un gradiente con una sorgente mobile 14. Nel saggio, chemiotattico viene rilasciato da una micropipetta mobile per generare un gradiente stabile. Con questo test l&#39;ago, i ricercatori hanno scoperto che le cellule diverse generano pseudopodi con caratteristiche fondamentalmente diverse. L&#39;applicazione di microscopia a fluorescenza, siamo stati in grado di visualizzare il gradiente per facilitare la sua misurazione quantitativa tutto 15. In questo studio, descriviamo metodi dettagliati per la preparazione chemiotattica HL60 (leucemia promielocitica umana), le cellule, il monitoraggio contemporaneamente più assa chemiotassiys con il dispositivo di analisi della mobilità delle cellule, e la visualizzazione dei GPCR-mediata dinamiche spazio-temporali di molecole di segnalazione come la proteina chinasi D1 in singole cellule vive in risposta a stimoli visibili, chemotattiche spatiotemporally controllabili. I nostri metodi di imaging avanzati possono essere applicati a studi generali chemiotassi, e sono particolarmente adatti per sistemi cellulari di mammifero.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medium GlutaMAX</td><td>Life technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Thermo Fisher Scietific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES soluzione sterile, pH 7.3</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>A611-J848-06</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione NucleofectorTM 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>AmaxaTM Linea cellulare NucleofectorTM Kit V che include Soluzione NucleofectorTM, pipette Singe use, AmaxaTM certificato 100 ml di alluminio cuvette per elettrodi</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek camerato #1.0 Borosilicato Coverglass</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>2% Soluzione di gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camere di vetro di copertura Lab-Tek II a pozzetto singolo</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Camere di vetro di copertura Lab-Tek II a quattro pozzetti</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-10438</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>F3506-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Spessore del vetro di copertura (2) 22 mm x 22 mm</td><td>Corning</td><td>2855-22</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>MIC-1001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan chip (5 mm)</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>EZT-F01-5</td><td></td></tr><tr><td>1701RN 10 &mu; l siringa</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II Punte per iniezione</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>TransferMan NK2, incluso modulo motore, testa X con regolatore dell'angolo e ausili per il posizionamento.</td><td>Eppendorf</td><td>5188900056</td><td></td></tr><tr><td>il software DIAS</td><td>Solltech Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale LSM 780 META o equivalente con obiettivo 40X 1,3 NA o 60X 1,4 NA olio DIC Plan-Neofluar</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging g protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule hl60 neutrofili-like

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Le cellule eucariotiche percepiscono e si muovono verso un gradiente chemioattrattivo, un processo cellulare chiamato chemiotassi. La chemiotassi svolge un ruolo critico in molti processi fisiologici, come l'embriogenesi, la modellazione dei neuroni, le metastasi delle cellule tumorali, il reclutamento di neutrofili nei siti di infiammazione e lo sviluppo dell'organismo modello Dictyostelium discoideum. Le cellule eucariotiche rilevano i chemio-attrattivi utilizzando recettori accoppiati a proteine G. I saggi visivi di chemiotassi sono essenziali per una migliore comprensione del modo in cui le cellule eucariotiche controllano la migrazione cellulare direzionale mediata da chemioattrattivi. Qui, descriviamo metodi dettagliati per: 1) il monitoraggio in tempo reale e ad alta risoluzione di più saggi chemiotassici e 2) la visualizzazione simultanea del gradiente chemioattrattivo e della dinamica spaziotemporale degli eventi di segnalazione in cellule HL60 simili ai neutrofili.

l&#39;imaging simultaneo di chemiotassi di più celle HL60 con dispositivo di analisi della mobilità delle cellule Sulla base del principio di microfluidica 16, il costruttore ha fornito profili simulati dei gradienti: un gradiente viene generato entro 1 minuto, stabilizzata entro 5 minuti, e mantenuta oltre 2 ore. I profili altamente prevedibili dei gradienti stabili generati da microfluidica consentono a più chemiotassi test da effettuare contemporaneamente. In questo studio, abbiamo osservato tre analisi chemiotattica simultanee (Figura 2a e Movie 1). Abbiamo scoperto che le cellule HL60 iniziato chemotaxing subito dopo il chemiotattico è stato iniettato nel pozzo del chemiotattico, e tenuto chemotaxing in un percorso rettilineo per i seguenti 60 minuti, in linea con i risultati della simulazione per la stabilità del gradiente. Tracciare il percorso di viaggio e la morfologiadelle celle consente misurazioni quantitative e successivo confronto dei comportamenti chemiotassi utilizzando un indice di chemiotassi che include la lunghezza totale del percorso, velocità, direzionalità e morbidezza delle cellule (Figura 2B). Lunghezza totale percorso è la somma delle lunghezze dei segmenti di linea che collegano i centroidi di percorso. Velocità si ottiene dividendo la lunghezza totale percorso dal tempo. Direzionalità è misurata verso l&#39;alto ed è definito come: (coordinata Y della fine del percorso meno coordinata Y d&#39;inizio) diviso per totale lunghezza del percorso. Questo dà 1.0 per un oggetto in movimento direttamente verso l&#39;alto. La rotondità della cella è una misura (in percentuale) di quanto efficientemente una data quantità di perimetro racchiude l&#39;area. Un cerchio ha la più ampia per un dato perimetro e ha un parametro di rotondità del 100%. Una linea retta racchiude nessuna area e ha un parametro rotondità 0%. Mostriamo il comportamento chemiotassi quantitativamente misurato come descritto dai parametri selezionati chemiotassi(Figura 2C). Monitoraggio PKD localizzazione subcellulare in cellule HL60 sotto un spatiotemporally visibile e controllabile stimolo fMLP Si tratta di un grande progresso tecnico ai fini fluorescente e stimolo chemiotattico controllabile ad un sistema sperimentale. Storicamente, abbiamo applicato sia omogeneo stimolazione (chiamato anche uniforme) o stimolazione gradiente di osservare la risposta delle cellule e comportamenti. Tuttavia, la stimolazione &quot;alla cieca&quot; non solo non fornisce alcuna informazione spazio-temporale su come lo stimolo raggiunge le cellule, ma getta anche in dubbio eventuali osservazioni &quot;anormali&quot; di risposta cellulare alla stimolazione, semplicemente perché non vediamo lo stimolo. Abbiamo precedentemente dimostrato che colorante fluorescente (Alexa594) può essere applicato con chemiotattico per stabilire una relazione lineare tra la concentrazione chemiotattico e mintensità colorante fluorescente onitored 15. Con una configurazione di acquisizione della proteina fluorescente verde (GFP), una emissione rossa di colorante fluorescente (Alexa594), e la luce trasmessa, siamo in grado di monitorare le cellule aderenti, l&#39;applicazione dello stimolo, e la risposta cellulare allo stimolo (Figura 3A). La proteina chinasi D è una famiglia di serina / treonina chinasi che svolgono ruoli essenziali nella migrazione delle cellule diretto 9,17. In risposta a uniformemente applicata la stimolazione fMLP (rosso), le cellule HL60 mediare una robusta membrana traslocazione di GFP-tagged proteina chinasi D1 (verde) (Figura 3B e Movie 2). In un gradiente fMLP (rosso) (Figura 4A), cellule HL60 reclutano attivamente PKD1 al bordo anteriore (Figura 4B e film 3). Un confronto attento della localizzazione subcellulare di GFP in sporgenza del bordo anteriore indica che PKD1 localizza nella parte posteriore del bordo anteriore (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> Figura 1. cellulare mobilità analizzatore consente fino a 6 analisi chemiotattica simultanee. (A) Schema mostra la progettazione di un chip di dispositivo di analisi della mobilità cellulare per il monitoraggio simultaneo di 6 analisi chemiotattica indipendenti. spettacoli Red chemiotattico aggiunti ai pozzetti. (B) Introduzione di cellule HL60 ai pozzi di cellule, mentre il fattore chemiotattico diffonde per stabilire una pendenza costante fMLP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> Figura 2. il monitoraggio simultaneo di molteplici analisi chemiotattica con le cellule HL60. (A </strong&gt;) Montaggio mostra le immagini della mobilità delle cellule saggio dispositivo di analisi chemiotassi per esaminare gli effetti inibitori degli inibitori PKD-specifici sulla chemiotassi nei momenti di 0 e 12 min dopo l&#39;applicazione del gradiente. cellule chemiotattica HL60 sono stati pre-trattati con inibitori PKD 1 micron CID755673 per 30 min. cellule HL60 con o senza il trattamento di inibitore PKD sono stati autorizzati a chemiotassi sia RPMI1640 medio morire di fame o 100 gradienti nM FMLP per 12 min. (B) Schema mostra la lunghezza del percorso di viaggio e la morfologia delle cellule HL60 tracciate. (C) Quantificazione dei chemiotassi la lunghezza totale del percorso, la velocità, la direzionalità, e rotondità. Media ± SD è mostrato; n = 10, 12, o 11 per nessuna sfumatura, fMLP pendenza senza trattamento CID755673, e il trattamento fMLP con il trattamento CID755673, rispettivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. GPCR-mediata robusta traslocazione della membrana di PKD1 in risposta a stimoli applicati omogeneamente FMLP. (A) monitoraggio multicanale di PKD1-GFP (green), chemiotattico (1 micron fMLP mescolato con 0,1 mg / ml colorante fluorescente Alexa 594, rosso) e DIC (differenziale contrasto interferenziale) per identificare le cellule HL60 aderenti in un pozzetto di una camera di 4well rivestito con 0,2% di gelatina in RPMI 1640 medium. Barra di scala = 10 micron. (B) Montaggio mostra che uniformemente applicata fMLP (rosso) induce robusta traslocazione della membrana di PKD1-GFP (green). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> figure 4. principale bordo localizzazione PKD1 in chemotaxing cellule HL60. configurazione acquisizione modalità (A) Canale facilita la visualizzazione del gradiente fMLP e le dinamiche spazio-temporali di PKD1. In A - C, le cellule HL60 transitoriamente espressi PKD1 GFP-tagged; visualizzare il gradiente fMLP generato da una micropipetta (DIC), 100 nM fMLP (rosso) è stato miscelato con 0,1 ug colorante fluorescente / ml Alexa 594. (B) localizzazione Arricchito di PKD1 all&#39;avanguardia della cella chemotaxing. Barra di scala = 10 micron. (C) fusione di immagini mostrano che PKD1 localizza nella parte posteriore del bordo d&#39;attacco in cellule HL60. Verde mostra PKD1 localizzazione cellulare, e l&#39;immagine DIC mostra la zona sporgente del bordo di attacco. Scala bar = 5 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

L'obiettivo generale di questo modello è consentire il monitoraggio simultaneo di più saggi di chemiotassi, oppure la visualizzazione di diversi eventi di segnalazione di una singola cellula chemiotattica. I biologi cellulari di Overdeck hanno sviluppato diversi approcci per quantificare il comportamento chemiotattico delle cellule. Fino a poco tempo fa, siamo stati in grado di rispondere a domande fondamentali nel campo della chemiotassi, come ad esempio, come monitorare simultaneamente più saggi di chemiotassi.Il principale vantaggio di questa tecnologia consiste nell'applicare il principio della microfluidica per generare ingredienti altamente riproducibili e affidabili per numerosi saggi di chemiotassi simultanei, con elevata risoluzione in tempo reale. A illustrare la procedura sarà il dottor Xi Wen, un ricercatore post dottorato del nostro laboratorio. Per assemblare il supporto, utilizzare innanzitutto le leve per posizionare la base in posizione verticale, in modo che le leve possano inclinarsi verso l'utilizzatore.Quindi, ricoprire brevemente la superficie del vetro da 41 millimetri con etanolo al 70% e utilizzare un fazzoletto per rimuovere con cura l'etanolo. Inserire il vetro nella base del supporto e posizionare un'immersione quadrata da 2 millimetri rivestita con BSA sulla superficie del vetro. Successivamente, inserire la piccola guarnizione O-ring nella parte inferiore dell'alloggiamento del wafer e montare l'alloggiamento del wafer nella base del supporto, con il foro ellittico rivolto verso la parte posteriore dello strumento.Estrarre il livello interno della base del supporto in avanti fino alla posizione orizzontale, per bloccare alloggiamento del wafer in posizione. Utilizzare una bomboletta d'aria per rimuovere eventuali detriti dall'interno dell'alloggiamento del wafer. Quindi aggiungere 4 millilitri di mezzo RPMI 1640, integrato con BSA 0,1%, all'alloggiamento.Ora, montare il chip del dispositivo per l'analisi della mobilit&agrave; cellulare rivestito con BSA al centro del supporto per wafer, con la faccia strutturale a contatto con il vetro e il segno di posizionamento nella parte posteriore. Inserire le due sporgenze sulla guarnizione di gomma nei fori per fissare la guarnizione alla base del morsetto per wafer, quindi montare la grande O-ring sulla parte superiore del supporto per wafer. Successivamente, montare il morsetto per wafer con il foro del sensore nella parte posteriore e tirare in avanti la leva esterna della base del supporto fino alla posizione orizzontale per bloccare il morsetto in posizione.Una volta assemblato il supporto, appoggiarne la parte inferiore su una scatola luminosa per verificare che non siano presenti bolle d'aria nei pozzetti. Quindi rimuovere il coperchio, trasferire l'assemblaggio sulla piastra posta sopra l'unità del dispositivo per l'analisi della mobilità cellulare e fissare il blocco sensore al supporto. Per eseguire il saggio di mobilità cellulare, innanzitutto sospendere le cellule HL60 differenziate in mezzo RPMI 1640 integrato con BSA, alla concentrazione di due volte dieci alla sesta cellule per millilitro.Quindi, collegare l'unità del dispositivo di analisi della mobilità cellulare al computer per l'acquisizione delle immagini e accendere entrambi i dispositivi. Successivamente, aprire il software del dispositivo di analisi della mobilità cellulare. Nel pannello di controllo dell'immagine della telecamera, utilizzare le linee orizzontali e verticali per regolare in tempo reale la posizione del supporto e centrare il dispositivo nel pannello dell'immagine della telecamera.Quindi selezionare il Canale Uno per spostare la telecamera sul canale selezionato e utilizzare Sposta a Sinistra o Sposta a Destra per regolare la coordinata X della telecamera in modo da centrare orizzontalmente il campo visivo. Per regolare verticalmente l'immagine al centro dello schermo, ruotare la manopola di posizione sul pannello frontale del dispositivo di analisi della mobilità cellulare. Sul pannello di controllo del riscaldatore, impostare la temperatura del supporto a 37 gradi Celsius e quella della piastra a 39 gradi Celsius.Per controllare la temperatura utilizzando il sensore termico collegato al supporto, fare clic su Riscaldamento per avviare il riscaldamento e quindi su Supporto. Nel pannello di acquisizione, inserire 15 secondi per l'Intervallo e 30 minuti per il Tempo per impostare rispettivamente gli intervalli e la durata del saggio di chemotassi. A scopo di sicurezza, selezionare la voce Spegni riscaldatore al termine dell'acquisizione.Quindi, salvare il file, inserire i dettagli dell'esperimento nel pannello delle note e verificare che il dispositivo sia centrato in tutti i canali. A questo punto, rimuovere tutto il tampone dal supporto e otto microlitri di tampone dal terzo pozzetto a partire dall'alto del primo canale. Utilizzando una siringa, iniettare due microlitri di cellule nel secondo pozzetto dello stesso canale, monitorando in tempo reale lo schermo per controllare il numero di cellule e il flusso durante l'iniezione.Quando le cellule sono allineate, aggiungere immediatamente gli otto microlitri di tampone nel pozzetto ed eseguire nuovamente l'iniezione cellulare nei canali da due a sei, come appena dimostrato. Dopo aver aggiunto tutte le cellule, aggiungere due millilitri di tampone nel supporto e aggiungere un microlitro di chemiotattrante nel terzo pozzetto a partire dall'alto nei canali appropriati. Infine, avviare l'acquisizione delle immagini.In questo esperimento rappresentativo, le cellule HL60 iniziano la chemotassi seguendo un percorso rettilineo immediatamente dopo l'iniezione dell'attrattante chimico, e continuano per l'intera durata del saggio, pari a 60 minuti, risultato coerente con le simulazioni sulla stabilità del gradiente. L'analisi del percorso di migrazione e della morfologia cellulare consente la misurazione quantitativa e il successivo confronto dei comportamenti chemotattici, mediante un indice di chemotassi che include la lunghezza totale del percorso, la direzionalità, la velocità e la rotondità delle cellule. L'applicazione di un colorante fluorescente, insieme all'attrattante chimico, permette di stabilire una relazione lineare tra la concentrazione dell'attrattante chimico e l'intensità fluorescente del colorante monitorata.Inoltre, in risposta a una stimolazione uniforme con chemiotattante, le cellule HL60 inducono un marcato translocamento della proteina chinasi D1 marcata con GFP sulla membrana. In un gradiente di chemiotattante, le cellule HL60 reclutano attivamente la chinasi nella parte posteriore del bordo lamellare. Una volta acquisita padronanza, questo processo può essere completato in 30 minuti se eseguito correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale seguire scrupolosamente le istruzioni del produttore per il montaggio del supporto e monitorare l'iniezione cellulare.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della chemiotassi per esplorare la possibilità di svariati saggi di chemiotassi, come il dictyostelium monogenico o altri tipi di sistemi cellulari mammiferi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come assemblare l'apparato, eseguire saggi di chemiotassi simultanei o visualizzare contemporaneamente diversi eventi di segnalazione nelle cellule chemiotattiche.

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In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

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