Deneysel Enfeksiyon Listeria monocytogenes Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

Bu protokolün genel hedefleri, listeria monocytogenes'in EGG suşu ile C57 blacksix farelerini yetiştirmek ve enfekte etmek ve bakteri yükünü, interferon gama yanıtlarını ve bu patojenin neden olduğu enfeksiyona karşı sağkalımı ve yanıtı ölçmektir. Bu protokol, araştırmacıların interferon gama tepkileri ve bakteriyel enfeksiyondan sonra hayvan sağkalımı üzerinde etkisi olan ajanları veya genleri taramasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, laboratuvarda kurulumunun nispeten basit olmasıdır.

Bakteri yetiştirme konusunda çok az deneyime sahip olanlar için bile. Ayrıca prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jennifer Ahn olacak. Steril bir pipet ucunu L monocytogenes EGG suşunun oda sıcaklığında çözülmüş gliserol stoğuna batırarak başlayın.

Ve hemen ucu bir beyin kalp infüzyonunun veya BHI plakasının bir bölümü boyunca ileri geri sürün. Bu birincil çizgidir. Plakayı 90 derece çevirin ve yeni bir pipet ucunu ilk çizgi boyunca sürükleyerek stoğu plakanın sonraki çeyreğine yayın.

Bu ikincil çizgidir. Ardından, üçüncül çizgiyi yapmak için ikincil çizgiyi çevirin ve plakanın üçüncü çeyreğine yayın. Şimdi, gece boyunca inkübasyon için plakayı 37 santigrat derecede ters çevirin.

Tek tip koloniler, 16 ila 24 saat arasındaki son çizgiler kümesinde görünür olmalıdır. Koloniler ortaya çıktığında, 10 mililitre steril BHI suyunu steril havalandırmalı 50 mililitrelik bir tüpe dağıtın ve bir L monocytogenes kolonisini plakadan et suyuna aktarmak için steril bir pipet ucu kullanın. Aşılanmış et suyunu, OD600 bire eşit olana kadar gece boyunca 37 santigrat derecede ve dakikada 225 dönüşte orbital çalkalama inkübatöründe kültürleyin.

Deneysel L monocytogenes enfeksiyon aşısının hazırlanması için, bir biyogüvenlik kabininde, bir gece boyunca 100 mikrolitre kültür ile bir BHI ortamı tüpü aşılayın. 37 santigrat derecede başka bir inkübasyondan sonra, istenen OD600'e ulaşılana kadar çalkalanarak, kültür içeriğini santrifüjleme için steril bir santrifüj tüpüne aktarın. Ve süpernatanı aspire etmek için ağartıcı içeren bir tuzak şişesine bağlı bir vakum kullanın.

Peletleri aynı santrifüj koşullarında PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, bakterileri PBS'de yeniden süspanse edin ve uygun konsantrasyonda seyreltin. İlgilenilen CFU'yu her fareye 200 mikrolitrelik bir hacimde sunmak.

Ardından, bakterilerin homojen bir şekilde dağıldığından emin olmak için süspansiyonu steril bir pipet ucuyla iyice karıştırın. Daha sonra 200 mikrolitre aşılamayı, 25 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik güvenlik mühendisliği şırıngasına çekin. Şimdi, omuzların etrafındaki gevşek deri tarafından daha az baskın olan bir fareyi tırnağın.

Ve her hayvan için yeni bir iğne ve şırınga kullanarak, 200 mikrolitrelik aşının tamamını karnın alt çeyreğine, mesaneden kaçınmak için orta hattın hemen yanına enjekte edin. En yüksek enfeksiyon bakteri yükünü ölçmek için, enfeksiyondan sonraki üçüncü günde, bir deney hayvanının uzuvlarını sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtası üzerinde kısıtlayın. Ve cildi yüzde 70 etanol ile dezenfekte edin.

Steril sert kesim makası kullanarak göğüsten kasıklara doğru bir kesi yapın. Daha sonra orta kasıktan her dizine doğru ve göğsün ortasından her dirseğe doğru bir kesi yapın. Cildi köreltin, inceleyin ve geri yansıtın, 25 gauge iğnelerle sabitleyin.

Kas tabakasını daha fazla yüzde 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra steril ince makas kullanarak periton duvarında orta hat kesisi yapın. Ksifoid sürecini kavramak için forseps kullanın.

Ksifoid işleminden başlayarak ve her iki tarafta yanal olarak hareket ederek periton duvarında kesiler yapın. Göğüs kafesini takip ederek diyaframın hemen altına kadar uzanır. Bu karaciğeri ortaya çıkaracaktır.

Ardından, bir lobdan yaklaşık 100 miligramlık bir parça kesmek için steril makas kullanın. Dokuyu, 0,2 ila 0,3 gram 1,5 ila 2 milimetre asitle yıkanmış steril cam boncuklar içeren önceden tartılmış 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Ve dalağı görselleştirmek için periton boşluğunun sol tarafındaki organları nazikçe kenara itmek için forsepsleri kullanın.

Dalağı nazikçe kavramak için forsepsleri kullanın, organı periton boşluğundan çıkarmak için çevredeki bağ dokusunu kesin. Dalağı karaciğerden farklı bir tüpe yerleştirin ve dokuları buz içeren sızdırmaz bir kapta laboratuvara aktarın. 30 hertz frekansında bir boncuk değirmeni homojenizatörü kullanırken tüpleri üç dakika çalkalayın.

Ardından, PBS'de yüzde 0.1 trident X 100'de homojenatların on kat seyreltme serisini ayarlayın. Ardından, her seyreltilmiş homojenatın 100 mikrolitresini bir BHI agar plakasına yaymak için steril bir yayıcı kullanın. Ve bir gece boyunca inkübasyon için plakaları 37 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın.

Plaka başına 300 koloni içeren plakaları saklayın. Her plakadaki kolonileri sayın. CT8 t hücresi interferon gama yanıtlarında CD4'ü ölçmek için, dalakları, az önce gösterildiği gibi patojenin dörtte ikisi ile enfekte olmuş farelerden patojenin dördüncü CFU'suna hasat edin.

Dalakları tek bir kırmızı kan hücresi yaşam süspansiyonuna işleyin. Ve peleti, FCS içeren tam RPMI ortamında mililitre konsantrasyonunda dört kez on ila altı hücrede yeniden süspanse edin. Daha sonra, çözülmüş, ısıyla öldürülmüş L monocytogenes hacminde eşit sayıda olan 24 oyuklu bir plakaya oyuk başına bir mililitre hücre tohumlayın ve soğuk kültürleri 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin.

20 saat sonra, kuyucuklara mililitre protein taşıma inhibitörü başına 0.66 mikrolitre ekleyin. Ve plakayı inkübatöre geri koyun. Dört saat sonra, bir biyogüvenlik kabininde, 500 mikrolitre kültür süpernatanı toplayın ve daha sonra Eliza tarafından interferon gama ölçümü için numuneleri eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Daha sonra hücreleri tek bir steril 15 mililitrelik tüpe aktarın, kuyucukları PBS ile yıkayın ve yıkamayı akış sitometrik boyama ve analiz için toplanan hücrelerle bir araya getirin. Bakteri yükünün zirvesi, enfeksiyondan iki ila üç gün sonra dalakta meydana gelir. Ve enfeksiyondan önce bir PPAR Alfa antagonistinin eklenmesiyle önemli ölçüde azalır.

Enfeksiyondan yedi gün sonra, dalak CD4 pozitif ve CD8 pozitif t hücrelerinin x vivo ısıyla öldürülmüş patojen ile yeniden uyarılması, akış sitometrisi ile tespit edildiği gibi CD4 pozitif ve CD8 pozitif hücrelerden pozitif bir interferon gama yanıtı ortaya çıkarır. Enfeksiyondan önce PPAR alfa antagonisti ile tedavi, CD4 ve CD8 hücreleri tarafından interferon gama yanıtlarını artırır. Ayrıca, PPAR alfa antagonisti tedavisi, patojenin LD50 dozu ile enfeksiyondan sonra sağkalımın çoğunu arttırır ve bu modelin, interferon gama tepkilerini modüle eden yeni ilaçların enfeksiyondan hayvan sağkalımı üzerindeki etkisini araştırmak için tesisini gösterir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu protokoldeki tüm prosedürler, uygun şekilde gerçekleştirilirse istenen verileri birkaç hafta içinde üretebilir. Teknik, fareleri model antijenleri eksprese eden listeria monocytogenes suşları ile enfekte ederek ve bu antijenler için spesifik MAC sınıf bir ve iki tetrameri ajan kullanarak daha da uyarlanabilir. Bu, enfeksiyon sonrası T hücresi genişlemesini ölçmeye izin verecektir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre içi patojenlere karşı konak bağışıklığında interferon gama'nın rolünü deşifre etmek için araçsal bir model haline geldi. Bu videoyu izledikten sonra, listeria monocytogenes ile C57 blacksix farelerinin nasıl yetiştirileceğini ve enfekte edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Ve enfeksiyona karşı geri takip yükünü ve interferon gama tepkilerini ölçmek için.

Listeria monocytogenes ile çalışmanın hamile kadınlar, çok genç veya yaşlılar gibi bağışıklık sistemi baskılanmış bireyler için tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, patojen yalnızca biyogüvenlik seviye iki koşullar altında immün yetkinliği olan kişiler tarafından ele alınmalıdır.