Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Hibrit-kesim doku kesit alma yönteminin genel amacı; sert liflere ve silika kristallerine sahip olan, kesime karşı dirençli bitki dokularının bütünlüğünü artırarak anatomik ve biyolojik çalışmalar için uygun doku örnekleri oluşturmaktır. Yüksek düzeyde kristal ve silika içeren bitkiler, kesit alma sırasında ciddi parafin yırtılmaları ve sorunlar yaşayabilir. Bu yöntem, doku bütünlüğünü önemli ölçüde artırır.

Bu tekniğin temel avantajı, kriyostat içindeki ultra düşük sıcaklıkta yapılan kesmenin parafin bloğunu sertleştirerek kristal kırılma problemini önemli ölçüde azaltmasıdır. Bu tekniğin uygulaması, diğerlerinin yanı sıra in situ hibridizasyon, FISH ve internal assess gibi yöntemlere genişletilebilir. Parafin bloğunun bir tablaya sıkıca yapışmasını sağlama adımları zorlayıcı olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Başlamak için, beş yaprak evresindeki olgun phalaenopsis orkide bitkileri seçin. Yaprakları orta damar boyunca yırtarak dikkatlice çıkarın. Keskin bir neşter kullanarak, monopodiyal sistemdeki üçüncü veya dördüncü yaprağın tabanındaki aksiller tomurcukları dikkatle çıkarın.

Numuneleri derhal 15 milliliters buz soğukluğunda PFA tespit çözeltisi içeren bir cam sintilasyon şişesine yerleştirin. Tespit çözeltisindeki numunelere dört degrees Celsius sıcaklıkta 15 ile 20 dakika boyunca vakum uygulayın. Numunelerden küçük kabarcıklar çıkacaktır.

Vakum bırakıldıktan sonra örneklerin çoğu çökene kadar bu adımı tekrarlayın. Son olarak, vakumu gece boyunca sürdürün ve ertesi gün yavaşça bırakın. Ardından, fikse edilmiş örnekleri 15 milliliters PBS içine daldırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.

Numuneleri, artan konsantrasyonlar serisi şeklinde 15 mililitre etanol içerisindedehidre edin. %30, %50, %70, %85, %95 ve son olarak %100. Numuneleri, oda sıcaklığında, hacimce ikiye bir oranında etanol ve ksilen muadili karışımının 15 mililitresi ile infiltre edin. İnfiltrasyonu, numuneleri sırasıyla aşağıdakilerin her birinden 15 mililitre içeren kaplara yerleştirerek sürdürün.

Bir bir hacimce hacme oranında etanol ve ksilen muadili karışımı, bir iki hacimce hacme oranında etanol ve ksilen muadili karışımı ve son olarak saf ksilen muadili kullanın. Ardından dokuları 60 °C'deki bir fırında inkübe edin. Örnekleri 60 °C'de 15 mL ksilen muadili ve parafin karışımı ile infiltre edin.

Son olarak, saf parafinde 15 milimetrelik derinlikte, 60 °C'de iki kez 12 saat boyunca infiltrasyon yapın. Bu adımı ertesi gün tekrarlayın. Gömme işlemine başlamak için öncelikle metal kalıpları 62 °C'ye ısıtın ve ardından kalıp tabanına yaklaşık 13 mL ergimiş balmumu dökün.

Isıtılmış pensle bir doku örneğini kalıba aktarın ve istediğiniz konuma göre yönlendirin. Kalıbı dikkatlice soğutma plakasına taşıyın ve balmumu katılaşana kadar bekletin. Ardından, parafin örnek bloğunu, üst kısmı yamuk bir yüzeye sahip ve uygun boyutta bir sütun haline getirmek için bir jilet kullanın.

Kriyostat tablasının merkezine 800 µL optik kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ekleyin. Parafin bloğunu tablanın üzerine yerleştirin ve doku bloğunu hızlıca istenen konuma göre yönlendirin. Parafin bloğunu ve tablayı bir kriyostat haznesine aktarın.

OCT'yi -42 °C'de 10 dakika boyunca hızlıca dondurun. Ardından, kriyostat adaptörünü ve hazne sıcaklığını sırasıyla -20 °C ve -16 °C'ye soğutun. Bloğu ve sahneyi kriyostat adaptörüne takın.

Şimdi, dokuları 10 µm kalınlığında kesin. Pens kullanarak doku kesitlerini alın ve poli-l-lizin kaplı bir lam üzerindeki 800 µL DEPC işleminden geçmiş suyun üzerinde yüzecek şekilde yerleştirin. Lamları 42 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı tabla üzerine aktarın.

Kesitlerin düzleşmesini bekleyin ve kenarlardaki fazla suyu emdirmek için filtre kağıdı kullanın. Dokunun lama yapışmasını sağlamak için örneği gece boyunca 42 °C'de ısıtıcı tabla üzerinde bırakın. Örneklerin parafinini uzaklaştırmak için önce lama monte edilmiş doku kesitlerini bir boyama rafına yerleştirin.

Bir boyama kavanozuna 150 mililitre ksilen ekleyin ve lamların bulunduğu rafı beş dakika boyunca içine daldırın. Ardından, örnekleri oda sıcaklığında, her biri 150 mililitre olan azalan etanol konsantrasyonlarına her seferinde üç dakika süreyle yerleştirerek yeniden hidrate edin. Son olarak, örnekleri üç dakika boyunca çift distile su içerisinde bekletin.

Lamları 1,5 dakika boyunca 150 mililitre hematoksilin çözeltisi içinde bekleterek numuneleri boyayın. Bir ila iki damla N hidroklorik asit içeren 150 mililitre çift distile su ile birkaç saniye boyunca durulayın ve ardından lamları çift distile su ile kısaca yıkayın. Numuneleri, oda sıcaklığında üç dakika boyunca, artan etanol konsantrasyonlarından oluşan 150 mililitrelik bir seri kullanarak bir kez dahaydehidre edin.

Numuneleri beş dakika boyunca 150 mililitre ksilen içinde bekletin. Son olarak, her bir lama nazikçe 600 mikrolitre ksilen bazlı kapatma medyumu ekleyip numunenin üzerine bir lamelle kapatarak örnekleri sabitleyin. Bu yöntem kullanılarak, yüksek düzeyde kristal içeren ve kesilmesi genellikle zor olan aksiller tomurcuk da dahil olmak üzere phalaenopsis orkidelerinin doku kesitleri elde edilmiştir.

Protein gövdelerinin görselleştirilmesine olanak tanıyan detaylı yapılar korunmuştur. Hibrit kesit, çimlenmiş tohumun sürgün apikal meristeminin görselleştirilmesi için ayrıca net kesitler sağlamıştır. Bu görüntüler, geleneksel parafin ile hibrit kesit tekniği kullanılarak hazırlanan pirinç ve buğday bitkilerinin enine yaprak kesitlerinin hazırlık aşamalarını göstermektedir.

Bu ürünler tipik olarak yüksek düzeylerde silika içerir ve bu durum onların kesitlenmesini zorlaştırır. Hibrit kesitlerde doku bütünlüğü önemli ölçüde iyileşmiş olup parafin örneklerinde genellikle bozulmuş veya bulunması zor olan temel yapılar, hibrit kesit dokusunda tamamen korunmuştur. Ayrıca, yırtılmalar yalnızca parafinle kesitlenen örneklerde gözlemlenmiştir.

Ek olarak, anatomik yapının güçlü bir şekilde korunması, hibrit kesit dokuları mekansal gen ekspresyon modelleri çalışmalarında kullanışlı hale getirir. Burada, phalaenopsis orkidelerinin ikinci ve üçüncü aksiller tomurcuklarının hibrit kesitlerinde Actin ve Cyclin B1:1 ile in situ hibridizasyon gerçekleştirilmiştir. İyileştirilmiş anatomik koruma, üçüncü aksiller tomurcukların gelişmekte olan meristematik hücrelerinde hedef genlerin daha yüksek ekspresyon seviyelerinin tespit edilmesine olanak sağlamıştır.

Bu prosedürü uygularken, parafin bloğunu sertleştirmek için sıcaklığın -16 °C'de tutulması önemlidir. Bu işlem, yüksek kaliteli doku kesitleri elde edilmesini sağlar. Geleneksel parafin veya kriyoseksiyon yöntemlerini kullanarak orkide üzerinde başarılı kesitler alma konusundaki birçok başarısız denememizin ardından bu yöntem fikri ortaya çıkmıştır.

Bu prosedürün ardından, genlerin uzaysal lokalizasyonu ve fonksiyonunun incelenmesi de dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon ve FISH gibi tüm deneyler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dirençli bitki örneklerinde yüksek kaliteli doku kesitinin nasıl alınacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.