Name: 양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 배우세요 q3DISM 기법을 활용하여 알츠하이머병 로덴트 모델에서 단핵대식세포의 아밀로이드-베타 탐식작용을 정량화하는 방법을. 이 기술은 3D 재구성과 치료제 테스트에 필수적인 도구입니다.

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M-V입니다. 지에스. BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award(A2015309F)와 Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award의 지원을 받고 있습니다. T.M.W.는 ARCS 재단과 John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship의 지원을 받습니다. 이 연구는 미국 국립신경장애질환연구소(National Institute on Neurologic Disorders and Stroke, 1R01NS076794-01, to T.T.), 알츠하이머협회 제니스 펠로우상(Alzheimer's Association Zenith Fellows Award, ZEN-10-174633, to T.T.), 미국노화연구연맹(American Federation of Aging Research)/엘리슨 의학재단(Ellison Medical Foundation)의 줄리 마틴 미드 커리어 어워드(Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research, M11472, to T.T.)의 지원을 받았다. 이 작업을 가능하게 하는 데 도움을 준 Zilkha Neurogenetic Institute의 초기 자금에 감사드립니다.

연구 윤리의 진술 : 여기에 설명 된 동물을 포함한 모든 실험은 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인 및 연구소의 평가 및 인증을위한 협회 국민 건강 지침의 연구소 및 권장 사항을 엄격히 준수 수행 하였다 동물 관리 국제. 1. 쥐의 뇌 분리 및 면역 염색을위한 준비 DAY 1 : <ol><li> 세 TgF344-AD 쥐를 놓습니다 (14 개월) 또는 연속 깊은 이소 플루 란 마취 (4 %)에서 APP / PS1 마우스 (12 개월). 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이와 철수 반사의 부재를 평가합니다. </li><li> 흉곽의 양쪽을 잘라 마음을 노출 올립니다. 심장의 좌심실로 23 G 바늘을 삽입하고 우심방에 작은 절개를합니다. 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수로 transcardial 관류하여 방혈로 진행연동 펌프 (마우스 30 mL를 150 - 쥐에 대한 200 ㎖)을 사용하여 (PBS). </li><li> 피부로 꼬리 정중선 절개를 확인하고 옆으로 피부와 근육을 이동합니다. 정중선을 따라 두개골 상부를 통해 상기 눈 사이 잘라. 뼈 플레이트를 제거하고 두개골에서 뇌 전체를 격리. </li><li> 코로나 쥐 뇌 매트릭스로 뇌를 놓고는 분기에 슬라이스. 4 ℃에서 파라 포름 알데히드 정착액 (PBS에서 4 % PFA)의 후방 분기 O / N (16 시간)을 품어. PBS에 세척 배 한 다음 70 % 에탄올로 전송할 수 있습니다. 주의 : PFA는 독성 및 적절한 개인 보호 장비와 화학 후드에서 처리되어야합니다. </li></ol> DAY 2 : <ol start="5"><li> 연속적으로 더 집중을 1 시간 에탄올 화장실에서 (70 %, 80 %, 95 %, 100 %의 X3를) 조직을 탈수 점진적으로 삽입 카세트에 뇌 분기를 놓고. </li><li> 3 개의 연속 100 % 크실렌 화장실 (1 시간마다)을 가진 조직에서 삭제 에탄올. 주의 : 크실렌은 독성 쉬입니다적절한 개인 보호 장비와 화학 후드 처리 할 울드. </li><li> (- 58 ° C, 90 분 각 56)이 용융 된 파라핀 왁스 목욕 후 파라핀 블록 조직을 포함. </li></ol> DAY 3 : <ol start="8"><li> 마이크로톰을 이용하여 파라핀 포함 된 두뇌의 10 μm의 두께 부분을 잘라. 수조 (1 분 50 ° C) 및에 딥 섹션은 슬라이드를 현미경에 적용됩니다. 슬라이드에 조직 유착을 보장, O / N을 건조 슬라이드를 둡니다. </li></ol> 2. 면역 염색 주 : 항체의 상이한 조합은 이하의 염색 과정에 이용 될 수있다. 쥐에서 뇌 조직과 호환 항체 칵테일은 표 1에 나열되어 있습니다. DAY 4 : <ol><li> 배 100 % 크실렌 화장실을 사용 Deparaffinize 뇌 섹션 (12 분 각각). </li><li> 연속 에탄올 욕 뇌 부분을 재수 - 100 % 10 분, 5 분 95 % 10 분 80 % 15 분 동안 마지막 70 % - followe배 PBS 세척 [빛 교반하면서 실온에서 5 분]에 의해 라. 한편, 95 열 항원 검색 솔루션 - 자기 바 교반 핫 플레이트에 97 ° C. </li><li> 30 분 동안 97 °의 C - 95에서 항원 검색 솔루션의 뇌 부분을 품어. 그런 다음, PBS의 배 세척 (빛 교반 RT에서 5 분). </li><li> 조직의 건조를 방지하고, 소수성 장벽 펜 조직 주변 소수성 장벽을 그리는 섬세한 작업이 와이퍼를 이용하여 신속하게 건조 슬라이드. 그리고 가습 챔버 내에서 1 시간 동안 RT에서 배양한다 [PBS 0.3 % 트리톤 X-100 및 10 % 정상 당나귀 혈청 (NDS)를 함유하는 완충액으로 차단 둘러싸인 조직 영역을 채운다. </li><li> 가습 챔버에서 4 ° C에서 O / N을 단핵 식세포 라벨 및 부화하기 (차단 버퍼에 희석) Iba1 차 항체와 버퍼를 차단 교체합니다. 항체 호스트와 작업 희석은 표 1 및 재료의 표를 참조하십시오. </li></ol> DAY 5 : <ol start="6"><li> 헹구기배 PBS 욕조와 차 항체 (빛 교반 RT에서 5 분). 배 PBS 화장실 다음에 (어둠 속에서 실온에서 버퍼를 차단에서) 1 시간 동안의 (a 594 nm의 방출 형광 물질과 결합) 형광 차 항체 (빛 교반 RT에서 5 분)에 품어. 이 때, 형광 신호 표백을 피하기 위해 어둠 속에서 섹션을 유지한다. </li></ol> DAY 6-7 : <ol start="7"><li> 반복 2.5 CD68 2.6 (쥐의 뇌) 또는 phagolysosomes 라벨을 램프 1 (마우스 조직) 항체 및 적절한 보조 항체 (488 nm의 방출 형광과 함께) 단계를 반복합니다. </li></ol> DAY 7-8 : <ol start="8"><li> 반복 Aβ 예금에 레이블 (A 647 나노 형광 결합) OC (쥐의 조직) 또는 4G8 (마우스 뇌) 항체 및 적절한 보조 항체 2.5 및 2.6 단계를 반복합니다. 참고 : 또는 6E10 항체는 마우스와 쥐 조직에 성공적으로 모두 사용할 수 있습니다. 적절한 항체 조합, 재료의 표를 참조하십시오 </str&gt; 옹. </li><li> 허용 섹션에 완전히 건조 O / 어둠 속에서 실온에서 N. 그런 다음, 커버 DAPI를 포함하는 형광 설치 미디어에 의해 밀봉 된 커버 슬립으로 표본. </li></ol> 대형 Z-스택 공 촛점 데이터 세트 3. 취득 참고 :이 프로토콜은 60X 목적 및 405 nm의, 488 nm의, 594 nm의 및 647 nm의 레이저가 장착 된 완전 자동화 된 레이저 스캐닝 공 초점 현미경이 필요합니다. 모든 장치는 영상화 레이저 제어 소프트웨어에 의해 제어되는 시스템이다. 컴퓨터, epifluorescent 램프, 현미경, 레이저와 카메라의 영상 프로토콜, 전원을 시작하기 전에. DAY 9 : <ol><li> 60X 현미경 목표를 선택합니다. 렌즈에 침지 기름을 추가하고 현미경 단계 슬라이드 홀더 상에 샘플을 배치합니다. 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 목표를 올립니다. 접안을 통해 epifluorescent 조명을 사용하여 해마 또는 대뇌 피질의 아밀로이드 플라크를 찾는 데 초점면을 조정합니다. </li><li> 공 초점 메신저 획득해마 또는 공 초점 현미경에 의한 설치류의 피질에서 아밀로이드 침착을 둘러싼 활성화 단핵 식세포의 나이 (60X 배율, Z-스택 단계 : 0.25 μm의 &lt;Z &lt;0.40 μm의 단계의 수 (25) &lt;N &lt;35). </li></ol> 4. q3DISM 참고 : 의미있는 결과를 산출하기 위해, 우리는 관심의 동물 / 지역 당 3 이미지의 최소를 분석하는 것이 좋습니다. 각 이미지의 경우, 분석 할 수있는 세포의 풍부한 실험 패러다임에 따라 다를 수 있습니다. (- D 및 2C - D도 1C를 참조 예로부터 멀리 또는 플라크와 관련된 단핵 식세포)가이 보고서에 나타난 대표적인 결과에서, 우리는 3 셀 / 상태를 분석 하였다. DAY 10 : <ol><li> 과학적인 3D 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 colocalization을 (coloc) 동시에 모든 Z-면에서 Iba1 / CD68 (쥐의 조직) 또는 Iba1 / 램프 1 (마우스 조직) 염색의 공간적 근접성을위한 모듈과 공 촛점 데이터 세트를 분석합니다.이바 + / CD68 + 또는 활성화 된 단핵 식세포 내에서 phagolysosomes에 해당 이바 + / 램프 1 + colocalization을 채널을 만듭니다. <ol><li> (CD68에 해당하는 또는 488 나노 형광과 함께 램프 1 염색) 채널 B에 대한 (594 나노 형광체와 결합 Iba1 염색에 해당) 채널 A의 TRITC 및 FITC를 선택합니다. &#39;모드 체크,&#39;선택 &#39;임계 값&#39;과 &#39;coloc 강도,&#39;선택 &#39;소스 채널&#39;에 대한 소프트웨어 창의 오른쪽에. </li><li> 소프트웨어 윈도우의 오른쪽에있는 &#39;coloc 색상을&#39;선택 &#39;수정&#39;을 클릭합니다. </li><li> 독립적으로 각 채널에 대해, 특정 염색을 포함하고 배경 / 비 특정 신호를 제외 할 임계 값을 조정합니다. 조정되면, 편견 분석을 위해 이미지 사이의 임계 값을 변경하지 마십시오. colocalized 복셀 (모든 Z-스택의 픽셀)는 모든 Z-스택 SIM의 단계 4.1.2에서 선택한 색상으로 표시됩니다ultaneously. </li><li> &#39;coloc 채널을 구축&#39;을 클릭합니다. 생성 된 colocalization을 채널은 화면 조정 창에 나타납니다. </li><li> 채널 통계를 엽니 다 coloc 채널을 클릭합니다. &#39;colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 재료 A의 %는&#39;램프 1 또는 CD68 신호 (488 나노 형광체에 해당하는 복셀)와 colocalized Iba1 신호합니다 (594 나노 형광체에 해당하는 복셀)의 %를 나타냅니다. 더 간단하게, 이것은 phagolysosomes (도 1C 및도 2C 참조)에 의해 점유 된 단핵구 볼륨이다. 참고 : &#39;colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 소재 B의 %는&#39;Iba1와 colocalized 램프 1 또는 CD68 신호 %에 해당한다. phagolysosomes은 세포 내 구조이기 때문에이 100 %에 가까워 야합니다. 값은 colocalized 임계 값 위의 모든 Z-스택에서 신호의 비율을 기준으로합니다. </li></ol></li><li> coloc 모듈을 사용하면, OC (래트 TI와 공간적 근접성 단계 4.1에서 생성 coloc 채널 분석ssue) 또는 4G8 (마우스 조직) Aβ 신호. 이 phagolysosomes 내에서 캡슐화 Aβ의 정량이 가능합니다. <ol><li> 채널을 (OC 또는 647 나노 형광체와 결합 4G8 염색에 해당) 채널 B 및 Cy5에합니다 (Iba1 / CD68 또는 Iba1 / 램프 1의 coloc 채널 단계 4.1에서 만든에 상당) coloc 데이터 세트를 선택합니다. </li><li> 4.1.5 단계 4.1.2에 설명 된대로 coloc 채널을 구축 할 수 있습니다. </li><li> 채널 통계를 엽니 다 coloc 채널을 클릭합니다. &#39;colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 재료 A의 %는&#39;Iba1 / 램프 1 또는 Iba1 / CD68 (복셀 단계 4.1.5에 내장 된 coloc 채널에 대응.) OC 또는 4G8 신호 (복셀은 647에 대응 colocalized의 %를 차지 나노 형광). 이는 Aβ (도 1D 및 2D 참조)에 의해 점유 된 포식 용해 소체 볼륨이다. 참고 : &#39;colocalized 임계 값 이상의 볼륨 / 소재 B의 %는&#39;phagolysosomes와 colocalized 총 Aβ 신호 %에 해당한다.이것은 phagolysosomes (본 대표적인 결과 미도시) 내에 캡슐화 총 Aβ 침착의 비율을 평가하는 데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 공 촛점 이미지 스택을 재구성 및 단핵구 phagolysosomes 내에서 캡슐화 Aβ의 3D 모델을 생성하기 위해 능가 모듈을 사용합니다. <ol><li> &#39;게재 조정&#39;창에서 (만 Iba1 염색을 표시하기 위해) TRITC을 선택합니다. &#39;볼륨 등록 정보&#39;창에서 &#39;새로운면을 추가&#39;를 클릭합니다. </li><li> 에서 &#39;1/5 알고리즘&#39;단계에서 &#39;설정&#39;, &#39;면&#39;을 선택합니다. 또한,의 &#39;색&#39;(적색도 (1B)와 (b)에 60 %의 투명도로 설정) 팔레트 또는 RGB 컬러 유형을 선택하고 투명도를 조정합니다. 확인란을 선택 &#39;관심 지역을 선택&#39;. 다음을 클릭합니다. </li><li> 단계에서 &#39;관심의 2/5 지역,&#39;x는, y를 조절하여 관심의 세포 주위에 창을 그릴 및 z 좌표는 (도 1a에 흰색 상자를 참조하십시오 </stroNG&gt;와 2A). 다음을 클릭합니다. </li><li> 단계 &#39;3/5 소스 채널&#39;에서 TRITC 소스 채널을 선택합니다. 0.4 μm의 상자 &#39;부드러운&#39;및 설정 표면적 상세 수준을 확인합니다. 내용은 &#39;임계&#39;절대 강도를 선택합니다. 다음을 클릭합니다. </li><li> 생성 된 볼륨이 TRITC 채널 신호와 완벽하게 겹치도록 단계에서 &#39;4/5 임계 값,&#39;임계 값을 조정합니다. 다음을 클릭합니다. </li><li> 단계에서 &#39;5/5는 표면을 분류,&#39;섹션에서 &#39;필터 유형&#39;에 포함 또는 생성 할 볼륨에서 제외 할 자신의 크기에 따라 개체를 선택합니다. 마침을 클릭합니다 모든 창조의 단계를 실행하고 마법사를 종료합니다. </li><li> 반복 FITC 채널 (램프 1 + 또는 CD68 + phagolysosomes)에 대한 3D 표면을 만들 4.3.1 4.3.6 단계를. </li><li> 반복 Cy5에 채널에 대한 (OC + 또는 4G8 + Aβ 예금) 3 차원 표면을 만들 4.3.1 4.3.6 단계를. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 단핵 식세포에 의해 생체 내에서 Aβ의 식세포 작용의 진정한 3D 정량이 보고서에서 설명하는 프로토콜은 특정 세포와 세포 내 구획의 표시뿐만 아니라 Aβ 예금에 의존한다. 특히, 우리는 Iba1 (이온화 된 칼슘이 어댑터 분자 1 바인딩), 세포 활성화 (18, 19)에 막 파동 운동과 식균 작용에 관여하는 단백질이 뇌 단핵 식세포를 염색하는 데 사용. Iba1 + 세포는 일반적으로 뇌의 미세 아교 상주 간주되는 반면, 말초 단핵 식세포 침윤이 immunolabeled 셀의 서브 세트를 포함 할 가능성이 남아있다. 램프 1 20 CD68 21 : 세포 내 phagolysosomes 항체가 리소좀 / 엔도 솜 관련 막 당 단백질 (LAMP) 가족의 구성원 인식에 공개됩니다. 후자는 주로 작은 분수가 셀 s의 순환과, 리소좀과 엔도 좀에 지역화urface. 램프 1과 CD68 항체는 모두 성...

알츠하이머 병 (AD), 가장 일반적으로 노인성 치매 1 &quot;치매&quot;β 아밀로이드 플라크 만성 낮은 수준의 신경 염증, 타우 병증, 신경 세포의 상실,인지 장애이 대뇌 아밀로이드 β (Aβ)의 축적을 특징으로 . AD 환자의 뇌에서 신경 염증이 성상 세포와 단핵 식세포 반응에 의해 책정되어 주변 Aβ 예금 3 (자신의 주변 기원은 불분명 대 중앙 있지만, 미세 아교 세포로 함). 중추 신경계의 선천성 면역 파수꾼으로, 미세 아교 세포는 중앙 뇌 Aβ을 취소 위치한다. 그러나, Aβ 플라크에 소교 모집이있는 경우, 약간의 Aβ의 식세포 작용 4,5 동반한다. 하나의 가설은 미세 아교 세포가 Aβ의 작은 어셈블리를 phagocytozing에 의해 초기에 신경 있다는 것입니다. 그러나 결국 이러한 세포는 압도적 인 Aβ 부담 및 / 또는 연령 관련 기능 D와 같은 신경 독성이 될ecline, 신경 독성과인지 기능 저하 (6)에 기여, 기능 장애 염증성 표현형에 미세 아교 세포를 불러 일으킨다. 최근 게놈 넓은 협회 연구 (GWAS)는 식균 작용 8-11을 조절하는 핵심 선천성 면역 경로 (7)에 속하는 AD 위험 대립 유전자의 클러스터를 확인했다. 따라서, 대뇌 아밀로이드 침착에 대한 면역 반응은 AD의 원인을 이해의 관점에서 새로운 치료 방법 개발 12-14 모두에 관심있는 주요 영역이되었다. 그러나, 생체 내에서 Aβ 식균 작용을 평가하는 방법에 대한 중요한 필요가있다. 이 충족되지 않은 요구를 충족하기 위해, 우리는 알츠하이머와 같은 질병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 Aβ의 식세포 작용의 진정한 3D 정량을 가능하게 실리 모델링 (q3DISM)의 양적 차원을 개발했다. 그들은 동물 모델 질병을 요점을 되풀이하는 정도에 의해서만 제한AD의 pathoetiology을 이해하고 실험적인 치료법을 평가하는 귀중한 입증. 프레 (PS) 및 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 유전자의 돌연변이는 상 염색체 우성 독립적 AD의 원인이된다는 사실로 인해, 이러한 돌연변이 유전자는 광범위하게 형질 전환 설치류 모델을 생성하는 데 사용되어왔다. 형질 전환 APP / PS1 마우스는 동시에 &quot;스웨덴어&quot;돌연변이 인간 APP (APP의 SWE) 및 가속 뇌 아밀로이드증과 신경 염증 (15, 16)에 존재 Δ 엑손 9 돌연변이 인간의 프레 1 (PS1ΔE9)를 coexpressing. 또한, 우리는 (피셔 (344) 배경에 라인 TgF344-AD) APP의 SWE와 PS1ΔE9 구조와 coinjected 이중 형질 전환 쥐를 생성했습니다. 뇌 아밀로이드증의 형질 전환 마우스 모델과 달리, TgF344-AD 쥐 타우 병증, 신경 세포의 사멸 손실 및 행동 장애 (17) 앞에 대뇌 아밀로이드을 개발한다. 이 보고서에서 우리는 IMM위한 프로토콜을 설명APP / PS1 마우스 및 TgF344-AD 쥐, 큰 Z 차원 공 촛점 이미지의 취득에서 뇌 부분에서 미세 아교 세포, phagolysosomes 및 Aβ 예금을 unostaining. 실리 생성 및 소교 phagolysosomes에 Aβ 흡수의 정량을 허용 공 초점 데이터 세트에서 진정한 3D 복원의 분석에서 우리는 세부 사항. 더 광범위하게, 여기에 자세히 우리 방법론은 생체 내에서 식균 사실상 어떠한 형태를 정량화하는데 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위 무딘 팁</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>23 G 바늘</td><td>VWR</td><td>BD305145</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프 FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>인산염 완충 식염수; 작업 집중력 1x</td></tr><tr><td>어른용 마우스 뇌 매트릭스, 코로나 슬라이스, 스테인레스 스틸 1 mm&nbsp;</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>성인 랫 브레인 매트릭스, 코로나 슬라이스, 스테인리스 스틸 1 mm&nbsp;</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>RBMS-305C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>32% 파라포름알데히드 수용액(PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>주의: 독성. 작업 농도: PBS</td></tr><tr><td>에탄올</td>에서 4% <td>VWR</td><td>89125-188</td><td>다양한 농도, 프로토콜 참조</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 및 침투 파라핀</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 Leica RM2125</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 마이크로톰 블레이드&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>수조 Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 슬라이드 Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>주의: 독성&nbsp;</td></tr><tr><td>Target Retrieval Solution 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>작업 농도 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>소수성 PAP 펜</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드 랙</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 항체 (다클론, 토끼)</td><td>Wako</td><td>019-19741&nbsp;</td><td>작업집중도 1:200</td></tr><tr><td>Iba1 항체 (polyclonal, goat)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>작업농도 1:200</td></tr><tr><td>rat CD68 [KP1] 항체 (monoclonal, mouse)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>작업농도 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD68 [FA-11] 항체 (monoclonal, rat)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>작업농도 1:200</td></tr><tr><td>mouse CD107a (LAMP1) 항체 (monoclonal, rat)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>작업농도 1:100</td></tr><tr><td>베타-아밀로이드, 17 - 24 (4G8) 항체 (단클론, 마우스)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>작업농도 1:200</td></tr><tr><td>베타-아밀로이드, 1 - 16 (6E10) 항체 (단클론, 마우스)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>작업농도 1:200</td></tr><tr><td>OC 항체 (다클론, 토끼)</td><td>D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)의 재능작업</td><td>농도 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 마우스 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>작동 농도 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 쥐 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>작동 농도 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 토끼 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>작동 농도 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>작동 집중 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 마우스 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>작동 집중 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 토끼 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>작동 집중 1:1,000</td></tr><tr><td>침수 오일</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1 컨포칼 현미경</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research 소프트웨어</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Bitplane 소프트웨어 버전 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td> <td>"coloc" 및 "supass" 모듈을 사용합니다.&nbsp; 또는 오픈 소스 프리웨어&nbsp; ImageJ는 공동 국소화에 사용할 수 있습니다&nbsp; 공초점 Z-스택 데이터 세트 분석.</td></tr></tbody></table>

양적 3d 인 실리코 모델링 (q3dism)

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

신경 염증은 이제 신경 퇴행성 질환의 주요 병인 요소로 인식되고 있습니다. 단핵 식세포는 식균 작용 및 파편과 이물질의 통관에 대한 책임 선천성 면역 세포이다. 이 세포들은 주변에서 침투 미세 아교 세포로 알려진 CNS 상주 식세포 및 단핵 식세포를 포함한다. 광학 현미경은 일반적으로 쥐 또는 인간의 두뇌 표본 식세포를 시각화하는데 사용되었다. 그러나 질적 방법은 생체 내 식균 작용의 결정적인 증거를 제공하지 않았습니다. 여기, 우리는 실리 모델링 (q3DISM), 설치류 알츠하이머 병 (AD) 모델에서 단핵 식세포에 의해 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 진정한 3D 정량을 가능하게하는 강력한 방법 양적 차원을 설명합니다. 이 방법은 형광 Aβ는 쥐의 뇌 섹션 phagolysosomes 내에서 캡슐화 시각화하는 것을 포함한다. 대형 Z 차원 공 촛점 데이터 세트는 3D는 A &amp; 정량을 위해 재구성# 946; 공간적으로 phagolysosome 내에서 colocalized. 우리는 마우스 및 래트의 뇌에 q3DISM의 성공적인 적용을 설명하지만,이 방법은 모든 조직에서의 거의 모든 식세포 이벤트에 확장 될 수있다.

q3DISM 위에서 상세히위한 다단계 방법을 사용하여, 우리는 APP / PS1 마우스 (도 1) 및 TgF344-AD 래트 (도 2)의 뇌에서 단핵 phagolysosomes으로 Aβ 흡수를 정량화 할 수있다. 따라서, q3DISM 방법론은 AD의 마우스 및 쥐 모델에서 단핵 식세포의 분석을 사용할 수있다. 흥미롭게도, CD68 + phagolysosomes가 차지하는 체적은 크게 두 APP / PS1 마우스 (도 1b, C) 및 TgF344-AD 래트 (도 2B, C)의 플라크로부터 떨어진 비교와 연관된 Iba1 + 단핵 식세포에서 증가된다. 이러한 데이터는 플라크 근처 단핵 식세포가 떨어져 플라크에서있는 세포에 비해 식균 작용을위한 태세 것으로 나타났다. 다른 Aβ 이형태 염색 데이터의 범위를 예시하기 위...

우리는 알츠하이머 병의 쥐 모델에서 단핵 식세포에 의해 대뇌 아밀로이드 β (Aβ) 식균 작용의 실리코 모델링 (q3DISM)의 양적 3D에 대한 방법론을 개발했다. 이 방법은 생체 내에서 거의 모든 식세포 이벤트의 정량화를 위해 일반화 될 수있다.

양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM)

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

이 정량적 3D 인실리코 모델링(q3DISM 기법)의 전반적인 목표는 알츠하이머병의 설치류 모델의 뇌에서 단핵 식세포에 의한 아밀로이드-베타의 흡수를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머 환자의 뇌에 축적되어 노인성 플라크를 형성하는 아밀로이드-베타의 제거율을 정량화하기 위한 알츠하이머 연구 분야의 긴급한 요구를 해결합니다. 이 기술은 처음으로 in vivo 대식세포에 의한 아밀로이드-베타의 진정한 3D 재구성 및 정량화를 가능하게 합니다.우리는 in vivo에서 마이크로세포 식세포작용을 시각화하고 정량화할 수 있는 강력한 도구가 필요했기 때문에 아밀로이드-베타 증착을 연구하기 위해 cued 3-Dist를 사용하기 시작했습니다.이 기술은 아밀로이드-베타의 효율적인 제거를 위해 어떤 약물이 대식세포를 자극하는지 평가하기 위해 실험적인 알츠하이머병 치료제를 테스트하는 데 유용할 수 있습니다. 조직 샘플이 면역 염색 준비가 되면 펜으로 둘러싸인 소수성 장벽 조직 영역을 차단 버퍼로 채우고 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 가습 챔버에서 섭씨 4도의 하룻밤 동안 차단 완충액을 첫 번째 관심 항체로 교체합니다.다음 날 아침, 실온에서 가벼운 교반으로 5분짜리 PBS 수조 3회에서 샘플을 세척합니다. 세 번째 세척 후, 빛으로부터 보호된 실온에서 적절한 형광 2차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 1시간 후 빛으로부터 보호된 PBS로 섹션을 세 번 더 세척합니다.그런 다음 방금 설명한 것처럼 다음 2-4일 동안 관심 있는 다른 조직에 적합한 1차 및 2차 항체로 세포를 라벨링합니다. 세포 및 초세포 구획과 아밀로이드-베타 침전물을 효율적으로 염색하기 위해서는 한 번에 하나의 1차 항체만 라벨링한 다음 해당 2차 항체로 라벨링하는 것이 중요합니다. 시간이 많이 걸리지만 결과를 최적화하는 프로세스입니다.2차 항체 염색을 마지막으로 세척한 후 어두운 곳에서 실온에서 절편을 밤새 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 형광 장착 매체로 밀봉된 커버 슬립으로 건조된 표본을 덮습니다. 컨포칼 현미경으로 샘플을 이미지화하려면 60x microscope objective를 선택하고 렌즈에 immersion oil을 추가합니다.샘플을 현미경 스테이지 슬라이드 홀더에 놓고 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 대물렌즈를 올립니다. 에피형광등 조명을 사용하여 초점면을 조정하여 해마 또는 대뇌 피질에서 아밀로이드 플라크를 찾습니다. 그런 다음, 해마 또는 피질의 아밀로이드 침전물을 둘러싸고 있는 활성화된 단핵 식세포의 컨포칼 이미지를 획득합니다.정성적 3D 인실리코(in silico) 모델링을 위해서는 먼저 모든 Z 평면에서 동시에 염색되는 활성화된 대식세포 마커 염색의 공간적 근접성을 확인하기 위해 분석 소프트웨어 공동 국소화 모듈에서 과학적인 3D 이미지 처리를 통해 컨포칼 데이터 세트를 분석합니다. 활성화된 단핵 식세포(mononuclear phagocytes) 내에서 식질소좀(phagolysosome) 염색에 해당하는 공동국소화 채널(colocalization channel)을 생성합니다. 채널 A에 대해 TRITC를 선택하고 채널 B.In 에 대해 FITC를 선택합니다.모드 확인 창에서 임계값을 선택합니다.공동 국소화 강도의 경우 Source Channels를 선택합니다. 편집을 클릭하여 공동 지역화 색상을 선택합니다. 그런 다음 각 채널의 임계값을 독립적으로 조정하여 특정 염색을 포함하고 배경 및 비특이적 신호를 제외합니다.colocalized voxels는 모든 z-stacks에서 동시에 선택된 colocalization 색상으로 나타납니다. 그런 다음 공동 지역화 채널 빌드(Build Colocalization Channel)를 클릭합니다. 생성된 동일 로컬 채널이 디스플레이 조정 창에 나타납니다.colocalization 채널을 클릭하여 채널 통계를 엽니다. 역치를 초과하여 공동국소화된 부피 물질 A의 비율은 식세포체가 차지하는 단핵구 부피를 나타냅니다. Colocalization Module을 사용하여 아밀로이드-베타 신호와의 공간적 근접성에 대한 공동국소화 채널을 분석하여 식질소체 내에 캡슐화된 아밀로이드-베타를 정량화합니다.채널 A의 공동 국소화 데이터 세트와 채널 B에 대한 Cy5를 선택하고 방금 설명한 대로 공동 국소화 채널을 구축합니다. 공동 현지화 채널을 클릭하여 채널 통계를 다시 엽니다. 역치를 초과하여 공동국소화된 부피 물질 A의 비율은 아밀로이드-베타가 차지하는 식리소좀 부피를 나타냅니다.Surpass 모듈을 사용하여 컨포칼 이미지 스택을 재구성하고 단핵구 식리소좀 내에 캡슐화된 아밀로이드-베타의 3D 모델을 생성합니다. Display Adjustment 창에서 TRITC를 선택하여 대식세포 염색만 표시하고 볼륨 속성에서 add new surface"를 클릭합니다. Settings(설정)의 5단계 중 1단계 algorithm(알고리즘)에서 Surface(표면)를 선택합니다.색상에서 관심 있는 색상 유형을 선택하고 투명도를 적절하게 조정합니다. 그런 다음 관심 영역 선택 상자를 선택하고 다음을 클릭합니다. 5단계 중 2단계인 관심 영역에서 X, Y 및 Z 좌표를 조정하여 관심 셀 주위에 창을 그리고 다음을 클릭합니다.5단계 중 3단계에서 소스 채널에서 TRITC 소스 채널을 선택하고 Smooth 상자를 선택합니다. 표면 영역 세부 수준을 0.4미크론으로 설정하고 다음을 클릭합니다. 5단계 중 4단계인 임계값에서 생성된 볼륨이 TRITC 채널 신호와 완벽하게 겹치도록 임계값을 조정하고 다음을 클릭합니다.마지막으로, 5단계 중 5단계인 곡면을 분류하고 Filter Types 섹션에서 크기에 따라 작성할 볼륨에 포함하거나 제외할 객체를 선택합니다. 동일한 단계를 반복하여 FITC 채널이 있는 식리소좀과 Cy5 채널이 있는 아밀로이드-베타에 대한 3차원 표면을 만듭니다. 방금 시연된 바와 같이 정성적 3D 인실리코(in silico) 모델링 후, 형질전환 마우스와 쥐의 뇌에 있는 단핵구 식소체로의 아밀로이드-베타 흡수를 분석할 수 있습니다.흥미롭게도, CD68 양성 식세포가 차지하는 부피는 생쥐와 쥐 모두에서 플라크에서 멀리 떨어져 있는 것과 비교하여 Iba1 양성 단핵 식세포에서 크게 증가하며, 이는 플라크에서 멀리 떨어진 세포에 비해 플라크 근처의 단핵 식세포가 식세포작용(phagocytosis)을 할 준비가 되어 있음을 보여줍니다. 또한 플라크와 관련된 단핵 식세포는 형질전환 마우스에서 플라크에서 멀리 떨어진 세포에 비해 아밀로이드-베타 흡수가 증가한 반면, 형질전환 쥐에서는 아밀로이드-베타 피브릴의 흡수가 전반적으로 매우 완만하게 관찰되며, 플라크로부터의 거리에 따른 함수로 아밀로이드-베타 피브릴 식세포작용의 뚜렷한 변화는 없습니다. 이 절차를 시도하는 동안 컨포칼 이미지의 품질이 매우 중요하며 공동 국소화 분석 중에 모든 채널에 대해 유사한 임계값을 적용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.개발 이후 이 기술은 신경염증 분야의 연구자들이 알츠하이머병의 설치류 모델의 뇌에서 식세포 현상을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 설치류의 뇌 절편에 단핵 식세포, 식작용 소체 및 아밀로이드-베타에 대한 레이블을 지정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. in vivo에서 3-D에서 대뇌 아밀로이드-베타의 식세포작용을 정량화합니다.

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Research

연구

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Medicine

의학

이 비디오는 알츠하이머병의 마우스 모델을 확립하기 위해 아밀로이드 베타를 치상회에 정확하게 입체적으로 주입하는 방법을 보여줍니다. 정확한 좌표 결정과 아밀로이드 베타 단백질의 제어된 전달은 신경 세포 분해를 초래하여 기억 처리를 방해하고 알츠하이머병 발병에 기여합니다.

알츠하이머병 모델을 위한 아밀로이드-베타 단백질의 직접 입체성 뇌 주입

출처: Arango-Lievano, M. et. al., 대뇌혈관 구조의 종단 생체 내 이미징: 중추신경계 질환과의 관련성. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 형광 표지된 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관 구조를 시각화하기 위한 생체 내 이광자 이미징을 보여줍니다. 파란색 형광은 플라크를 표시하고 녹색 형광은 뇌 혈관을 강조합니다. 관심 영역의 3D 지도와 고해상도 모자이크 이미징은 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관의 상세한 상호 작용을 보여줍니다.

알츠하이머병 마우스 모델에서 대뇌혈관 및 아밀로이드 플라크의 생체 내 이미징

여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

아밀로이드-β (Aβ)의 동물 모델에 정의 된 수량 및 Aβ 단편 종의 관리를 가능하게하고 각 연구 그룹 내의 개별 차이를 줄여 주사 하였을. 이 프로토콜은 정상 마우스에서 알츠하이머와 같은 행동 이상의 생산을 가능하게 정위기구없이 Aβ​​의 뇌실 (ICV) 주입을 설​​명합니다.

일반 마우스의 아밀로이드-β의 펩티드의 뇌 실내 주사는 급성 치매와 같은인지 적자를 유도합니다

이 문서는 혈액 - 뇌 장벽을 통과 선택적 β-주름에 조밀 한 핵심 Aβ 플라크에있는 시트를 결합 메 톡시 X04을 사용하여 알츠하이머 병 마우스 모델에서 아밀로이드 아밀로이드 베타 플라크를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이는 전자 현미경을위한 면역 염색 처리 전에 플라크 - 함유 조직 절편의 예비 스크리닝 할 수있다.

상호 빛과 전자 현미경은 β - 아밀로이드 플라크와 소교의 상호 작용을 연구하는

여기에는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에서인지 및 기능 운동 행동에 대한 생체 내 효능을 나타내는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수있는 단계적 행동 스크리닝 방법이 기재되어있다. 이 방법은 단기 및 작업 메모리 작업에서 활동을 위해 화합물을 스크리닝하기 위해 최적화됩니다.

아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

이 프로토콜은 세포를 고정화시키는 알긴산의 신속한 물리적 겔화에 의한 세포 캡슐화 방법을 예시한다. 얻어진 마이크로비드는 시간이 지남에 따라 아밀로이드-β의 제어되고 지속적인 분비를 허용하고 시험관 내 및 생체 내 모델에서 분비 된 아밀로이드-β의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

알츠하이머 병 모델링에 사용하기 위한 아밀로이드-β-분비 알긴산 마이크로비드 의 제조

본 프로토콜은 알츠하이머병의 APP/PS1 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 부하를 정량화하기 위해 시상 마우스 뇌 절편의 전체 영역 또는 관심 영역 분석을 수행하는 절차를 설명하고 비교한다.

마우스 뇌 절편에 대한 아밀로이드-베타 부하의 전체 대 하위 지역 정량화

여기에서는 알츠하이머병(AD) 뉴런에서 신경독성 β-아밀로이드(Aβ) 생성을 실시간으로 증가 또는 유지하여 미토콘드리아 관련 소포체(ER) 막(MAM)의 구성 안정제의 축삭 수송 속도를 측정하여 MAM 안정화를 측정하고 AD 치료제 개발을 돕기 위한 직접적이고 정량적인 지표로 사용하는 방법을 설명합니다.

알츠하이머병(AD)의 신경 모델에서 미토콘드리아 관련 소포막(MAM) 안정화의 정량적 분석 

알츠하이머 병 환자가 인식 메모리 작업을 수행하면서 높은 밀도 이벤트 관련 잠재적인 데이터 수집을위한 방법론을 검토합니다. 이 프로토콜은 주제 준비, 품질 보증, 데이터 수집, 데이터 분석이 포함됩니다.

알츠하이머 병 환자에서 이벤트 관련 후보를 사용하여 에피소드 메모리의 특성을 검토

배우세요 q3DISM 기법을 활용하여 알츠하이머병 로덴트 모델에서 단핵대식세포의 아밀로이드-베타 탐식작용을 정량화하는 방법을. 이 기술은 3D 재구성과 치료제 테스트에 필수적인 도구입니다.

양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM)

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