Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esplorare la funzione genica in Dermestes maculatus, un nuovo sistema modello di insetti, che rappresenta il diverso clade di coleotteri, e facilita lo studio di questioni di ricerca di base e applicate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, della biologia evolutiva e oltre, rendendo possibile testare la funzione genica negli embrioni e negli adulti di Dermestes. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'interferenza dell'RNA può essere utilizzata per colpire qualsiasi gene, basandosi solo sulle informazioni di sequenza, anche in assenza di una sequenza completa del genoma.

I metodi qui introdotti non solo forniscono un approccio per studiare la funzione genica in Dermestes. Possono anche essere applicati per sviluppare nuovi sistemi modello di insetti e potenzialmente per controllare gli insetti nocivi. Per preparare una gabbia di allevamento per un D. maculatus, stendere prima un sottile strato di trucioli di legno in una gabbia per insetti di medie dimensioni.

Metti una sezione di polistirolo nella gabbia per consentire alle larve un ambiente in cui impuparsi. Aggiungi da venti a cinquanta coleotteri adulti o larve di stadio tardivo alla gabbia. Metti il cibo umido per gatti in una capsula di Petri o in una barca di pesatura, come fonte di cibo.

Copri la gabbia con un panno a rete e mettila in un'incubatrice. Prima di iniziare la raccolta degli embrioni, controlla attentamente la gabbia per verificare la presenza di eventuali embrioni e rimuovili. Una volta che la gabbia è libera, posiziona un batuffolo di cotone teso nella gabbia e incuba la colonia a 30 gradi Celsius.

Dopo l'opportuna finestra temporale, raccogli il batuffolo di cotone, rimuovi gli adulti presenti e rimettili nella gabbia. Su un pezzo di carta da costruzione nera, pizzica delicatamente il batuffolo di cotone e strappalo lentamente in un filamento sottile, in modo che le uova presenti cadano sulla carta nera. Prendi un coperchio standard per piastre di Petri e usa un pezzo di carta da filtro nera per coprire l'interno.

Attacca un pezzo di nastro biadesivo lungo il bordo di un vetrino da microscopio standard. Posizionare il vetrino del microscopio sulla carta da filtro nera nel coperchio della capsula di Petri. Prendendo la carta contenente gli embrioni raccolti, picchiettare delicatamente per trasferire gli embrioni nel coperchio della capsula di Petri.

Utilizzando un pennello, allineare gli embrioni sul nastro perpendicolarmente al vetrino, con l'estremità anteriore o posteriore verso il bordo. Per iniziare l'RNAi, prelevare prima 2-4 microlitri di dsRNA in un puntale per pipette con caricatore micro da 20 microlitri. Inserire la punta in un capillare di vetro pre-estratto, denominato ago, e pipettare delicatamente la soluzione nell'ago.

Fissare l'ago in un supporto capillare di vetro e quindi assemblare il supporto capillare nel micromanipolatore. Quindi, trasferire con cura il vetrino con gli embrioni attaccati al tavolino del microscopio da dissezione. Sposta il vetrino per portare un embrione al centro del campo e metti a fuoco il microscopio.

Mentre si guarda nell'oscilloscopio di dissezione, posizionare la punta del capillare con il micromanipolatore. Avvicina la punta all'estremità del primo embrione della fila. Accendere l'alimentazione di azoto o aria, quindi impostare il selettore di ingresso del solenoide sul vuoto.

Regolare il regolatore della pressione di espulsione su 10-15 psi, a seconda dell'apparecchio. Apri il capillare e la soluzione colorata di dsRNA riempirà la punta, pronta per l'iniezione. Sposta la punta del capillare in avanti e perfora delicatamente l'embrione.

Con impostazioni di pressione ideali, nessun fluido embrionale fluirà nel capillare. Premere l'interruttore a pedale per espellere il dsRNA nell'embrione, fino a quando non viene erogata la quantità appropriata. Lasciare la punta all'interno dell'embrione per circa due secondi, quindi rimuoverla con cura.

Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, posizionare il vetrino in una capsula di Petri. Aggiungere un batuffolo di cotone bagnato al piatto, facendo attenzione a non farlo entrare in contatto con lo scivolo. Coprire la capsula di Petri e avvolgerla con pellicola sigillante.

Etichettalo con il tipo di dsRNA, la concentrazione, la data, l'ora e il numero di embrioni iniettati. Infine, metti il piatto in un'incubatrice a 30 gradi Celsius fino alla schiusa degli embrioni. Per eseguire il pRNAi, raccogli prima le pupe dalla colonia.

Ordina le pupe maschili e femminili in due piatti separati e mettile in un'incubatrice a 30 gradi Celsius. Controlla quotidianamente le piastre per verificare la presenza di coleotteri chiusi e trasferisci questi individui in due piastre di Petri separate per adulti maschi e femmine. Nutrire questi adulti e mantenere le piastre a giorni alterni, fino a quando un numero sufficiente di adulti non si è chiuso per iniziare l'iniezione.

Una volta completato il pool di adulti, anestetizzare una femmina di coleottero e tenere il lato ventrale individuale verso l'alto con una mano, tenendo la siringa nell'altra. Penetrare delicatamente la membrana dei segmacoria tra gli sterniti 2 e 3. Controllare la scala della siringa ed erogare lentamente circa due microlitri per femmina.

Dopo l'iniezione, tenere fermo l'ago per almeno 5 secondi e poi estrarlo con cautela. Trasferire le femmine iniettate in una capsula di Petri con cibo per gatti. Etichetta il piatto in modo appropriato.

Metti il piatto in un'incubatrice a 30 gradi Celsius. Dopo 24 ore, trasferisci le femmine iniettate in una mini gabbia e aggiungi un numero uguale di giovani maschi non iniettati. Etichetta la gabbia e aggiungi del cibo per gatti.

Posizionare la gabbia in un'incubatrice a 30 gradi Celsius, per consentire l'accoppiamento. La prole risultante può quindi essere esaminata per determinare gli effetti del pRNAi. Questa immagine mostra una progenie di un individuo pRNAi iniettato con DS GFP, proteina fluorescente verde come controllo.

Qui, come negli individui di tipo selvatico, la prole si è schiusa con una striscia pigmentata per segmento. Le strisce pigmentate vicine erano separate da una fessura non pigmentata. Dopo l'accoppiamento del pRNAi, la prole affetta si è schiusa con strisce pigmentate vicine fuse, indicando confini segmentali difettosi.

La gravità fenotipica era variabile, ma le fusioni apparivano costantemente in alcune regioni limite, indicando difetti simili alla regola della coppia. Allo stesso modo, i fenotipi della cuticola degli embrioni non schiusi dopo il knockdown accoppiato hanno mostrato la perdita dei segmenti addominali, così come la lunghezza del corpo ridotta. La colorazione degli embrioni precoci con anticorpi engrailed per esaminare i difetti molecolari ha mostrato strisce di espressione di uguale intensità in ciascun segmento negli individui di controllo.

Al contrario, è stata rilevata una ridotta espressione in strisce alternate nella prole di femmine iniettate con dsRNA accoppiate a Dmac. Questo modello di espressione ridotta è coerente con il modello difettoso della cuticola osservato nelle larve schiuse colpite. Qui, per la prima volta, presentiamo il nostro protocollo per abbattere un gene di interesse, durante lo sviluppo embrionale precoce in Dermestes maculatus, utilizzando l'interferenza dell'RNA.

Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordare di utilizzare embrioni o femmine adulte nella fase appropriata. Una volta padroneggiato, l'iniezione di circa 100 embrioni o 10 femmine adulte può essere eseguita entro mezz'ora. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la colorazione dell'embrione o la PCR quantitativa, al fine di rispondere a ulteriori domande sui meccanismi di regolazione genica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare una colonia di laboratorio Dermestes ed eseguire l'interferenza dell'RNA embrionale e parentale in questo coleottero. Attualmente, solo un piccolo numero di modelli di insetti è disponibile per studi funzionali. Le tecniche qui presentate aprono la strada ai ricercatori per utilizzare Dermestes come sistema modello, ampliando la portata degli insetti suscettibili di analisi genetiche molecolari.