暴露在生理条件下的氧气在人体细胞中帽结合蛋白质分析

本实验的总体目标是在低氧条件下捕获帽结合蛋白。该方法利用琼脂糖连接的 7 甲基鸟苷帽类似物来研究帽结合因子及其相互作用的伴侣。该方法将有助于回答蛋白质合成领域的关键问题，例如识别参与帽依赖性翻译的新型氧调节因子。

该技术的主要优点是细胞一直保存在缺氧工作站中，直到裂解点。这项技术的影响延伸到癌症治疗，因为肿瘤内的癌细胞暴露于非常低的氧水平，并且翻译控制在肿瘤进展中起着关键作用。当我们阅读 Corona 同事最近发表的一篇文章时，我们第一次有了这种方法的想法，该出版物称组织氧合实际上更接近我们所说的缺氧，而不是细胞常规培养的正常状态。

按照文本协议中的说明开始此过程将进行细胞培养。使用血细胞计数器计数细胞后，补料 150 毫米培养皿，其中含有 15 毫升完全培养基，以获得每平方厘米 2500 至 5000 个细胞的细胞密度。每次帽结合测定使用两个 150 毫米培养皿。

将接种的培养皿放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳气氛的培养箱中。细胞孵育至少 24 小时后，将细胞放入缺氧工作站中所需时间。然后，将工作站设置为适当的生理。

将 1 X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和胰蛋白酶在 37 摄氏度的水浴中预热 30 分钟。将 980 μL 裂解缓冲液分装到 1.5 μL 离心管中，用于每次进行帽结合测定。将 10 μL 100X 蛋白酶抑制剂混合物和 10 μL 4-苯磺酰氟氢环化物加入 980 μL 冰上裂解缓冲液中。

将每个 150 毫米培养皿中的培养基丢弃在缺氧工作站内的废液容器中。然后，用 3 到 4 毫升温热的 1 X PBS 洗涤细胞并丢弃液体。向每个培养皿中加入 1 毫升温热的 05% 胰蛋白酶 EDTA，让培养皿静置 2 分钟或直到细胞不再粘附在培养板上。

使用移液器将一个板的细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中。根据需要重复，以便将每块细胞板转移到单独的 1.5 mL 微量离心管中。将微量离心管以 6000 次 g 离心 90 秒以沉淀细胞。

离心后，使用移液管吸出胰蛋白酶，而不会干扰沉淀。将 200 微升 PBS 轻轻移液到沉淀上方的试管中，用温热的 1 X PBS 洗涤细胞。然后在不干扰沉淀的情况下吸出 PBS。

接下来，从 1 毫升制备的裂解缓冲液中吸取 500 微升移液到第一个细胞沉淀上。通过上下移液完全重新悬浮沉淀。将重新悬浮的细胞与第二个细胞沉淀混合，并通过上下移液重新悬浮第二个沉淀。

重复此过程，直到每个样品的所有沉淀都合并并重新悬浮。接下来，将裂解物与剩余的 500 μL 裂解缓冲液混合在 1.5 L 微量离心管中。从 hypoxia 工作站中取出样品。

4 摄氏度下旋转样品 1.5 至 2 小时，轻轻搅拌裂解细胞。孵育后，将裂解的细胞在 4 摄氏度下以 1200 倍 g 离心 15 分钟，以去除细胞碎片。将裂解物转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并丢弃沉淀。

保留一部分上清液用作 western blot 分析的全细胞裂解物起始对照。为了准备帽结合测定，请使用剪刀去除移液器的尖端，以促进珠浆的收集。对于每个样品，转移 50 μL 空白琼脂糖珠对照浆液和 50 μL m7GTP 琼脂糖 C10 连接珠浆液，以分离 1.5 mL微量离心管。

然后，通过以 500 倍 g 离心浆液 30 秒来沉淀珠子。小心去除上清液，并将珠子重新悬浮在 500 微升 TBS 中。重复这些步骤后，以 500 次 g 沉淀珠子 30 秒，然后去除上清液。

接下来，将含有裂解物的上清液转移到含有空白琼脂糖珠的 1.5 mL 微量离心管中。在 4 摄氏度下孵育 10 分钟，轻轻搅拌。10 分钟后，以 500 次 g 离心 30 秒，使空白琼脂糖珠沉淀。

离心后，将不与磁珠结合的裂解液转移到含有 m7GTP 琼脂糖 C10 连接磁珠的 1.5 mL 微量离心管中。将微珠重悬于 500 μL 裂解缓冲液中，洗涤空白琼脂糖微珠，以 500 次 g 离心 30 秒沉淀微珠，并丢弃上清液。重复此作 4 次，总共洗涤 5 次。

空白琼脂糖珠重悬于一个 X SDS-PAGE 样品缓冲液中。并将珠子在 90 摄氏度下煮 95 秒。将样品储存在 20 摄氏度以备将来蛋白质印迹分析，以观察目标蛋白质与磁珠非特异性结合的天气。

将裂解物与 m7GTP 琼脂糖 C10 连接珠子在 4 摄氏度下轻轻搅拌孵育 1 小时，以捕获帽结合蛋白。搅拌后，以 500 次 g 离心 30 秒，使 m7GTP 琼脂糖 C10 连接的珠子沉淀。弃去上清液后，像以前一样洗涤 m7GTP 琼脂糖 C10 连接的珠子。

磁珠重悬于 600 μL 裂解缓冲液中，并添加 GTP 至终浓度为 1 毫摩尔。将 m7GTP 琼脂糖 C10 连接珠子加 1 毫摩尔 GTP 在 4 摄氏度下轻轻搅拌孵育 1 小时。这将解离与 m7GTP 非特异性相互作用的蛋白质。

以 500 次 g 离心 30 秒，使 m7GTP 琼脂糖 C10 连接的珠子沉淀。将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并加入 200 μL 的 4 X SDS-PAGE 样品缓冲液。像以前一样洗涤磁珠后，将磁珠重新悬浮在一个 X SDS-PAGE 样品缓冲液中，并在 95 摄氏度下煮沸 90 秒。

此处显示的是响应原代人肾近端肾小管上皮细胞中氧波动的典型 m7GTP 亲和纯化的典型 m7GTP 亲和纯化的代表性蛋白质印迹。将细胞裂解物暴露于 8%、5%、3% 或 1% 的氧气中 24 小时。泳道包括 10% 的全细胞裂解物作为输入，洗涤 GTP 以测量 m7GTP 的特异性，以及 GTP 洗涤后与 m7GTP 珠结合的蛋白质。

通过图像 J 对至少三个独立实验的数据进行量化，并表示为相对于整个细胞裂解物 10% 起始量的相对密度单位。结果表明，在生理氧下培养的人类细胞利用两种帽结合蛋白募集不同的 mRNA 进行翻译。观看此视频后，您应该对如何在低氧条件下捕获帽结合蛋白有很好的了解。

在尝试此过程时，重要的是要记住将细胞保持在缺氧工作站中直到裂解点，因为氧气会迅速改变这些翻译起始因子的生化特性。按照此程序，可以执行其他方法（如多核糖体分级分离）来回答其他问题，例如在低氧条件下哪些帽结合蛋白与活性翻译相关。