Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

Merhaba, benim adım Dimitry Samigullin. Rusya Bilimler Akademisi'ne bağlı Kazan Biyokimya ve Biyofizik Enstitüsü'nün Sinaptik Süreçler Biyofizik laboratuvarında çalışıyorum. Laboratuvarımızda, nöromüsküler kavşaktaki kalsiyum sinyalizasyonunun çeşitli yollarını inceliyoruz. Sinaptik kalsiyum düzeyini ölçmek için en erişilebilir yöntemlerden biri optik kayıttır.

Burada, kurbağa sinir uçlarında, bir sinir güdüğü aracılığıyla kalsiyuma duyarlı bir boyanın yükleme yöntemini açıklıyoruz. Ayrıca, kurbağa terminallerindeki geniş kalsiyum geçişinin ölçümü ve analizi için protokolü sunuyoruz. Bu yöntem kullanılarak, sinaptik aktivite sırasında kalsiyumun presinaptik seviyesi üzerindeki aktif ilaçların etkisi incelenebilir.

Boya yükleme solüsyonunun hazırlanması. Fluorescein'in Kalsiyum Boyası Oregon Green BAPTA, 500 mikrolitre hacminde, küçük bir miktar olan 500 mikrogram toz şeklinde gelir. Toza, HEPES içeren 14 mikrolitre solüsyon ekleyin.

Yükleme solüsyonunu vorteksleyin ve tamamen karışması için santrifüjle çöktürün. Işığa maruz kalmasını önlemek için yükleme solüsyonunun bulunduğu viyali folyo ile sarın. Yükleme solüsyonunu bir dondurucuda -20 °C'de saklayın.

Boya yükleme prosedürü. Hayvandan bir kutanöz pectoris kası disseke edin. Disseke edilen dokuyu gümüş kaplı bir Petri kabına yerleştirin.

Dokuyu ince paslanmaz çelik iğnelerle gerin. Petri kabına Ringer çözeltisi ekleyin. Bir jilet kullanarak, on mikrolitrelik pipet ucunun ince ucundan yaklaşık 2 milimetrelik küçük bir parça kesin.

Petri kabı üzerinde dolum pipetini sabitlemek için bir parça oyun hamuru hazırlayın. Dolum pipetini, bir silikon tüp ve pipet tüplerinden yapılmış adaptörler aracılığıyla plastik bir şırıngaya bağlayın. Geçici Ringer çözeltisini, plastik bir pipet yardımıyla Petri kabından uzaklaştırın.

Şırınga ile kuru hazırlama. Bu, doldurma pipetine solüsyonun çekilmesini önleyecektir. Yükleme solüsyonu içeren şişeyi dondurucudan çıkarın ve karanlık bir yerde, oda sıcaklığında çözülmeye bırakın.

Görsel kontrol altında, steril bir mikroskop eşliğinde, ince bir cımbız ve makas kullanarak siniri kasın hemen yakınından kesin. Yaklaşık iki milimetrelik bir sinir güdüğü bırakın. Dolum pipetini bir tüp ve şırınga ile birlikte plastikin kullanarak Petri kabına sabitleyin.

Sinir dalına yaklaştırın. Sinir kütüğünü dolum pipetine nazikçe aspire edin. Emme tüpünü dolum pipetinin küt ucundan çıkarın.

Dolum pipetindeki sinir güdüğünü şırınga yardımıyla kurulayın. Dolum pipetini sinir güdüğüyle birlikte yukarı kaldırın. Sinir güdüğünü dış ortamdan Vazelin ile izole edin.

Şırınga yardımıyla doldurma pipetindeki sinir kütüğünü bir kez daha kurulayın. Uzun uçlu bir pipet kullanarak 0.5 µL yükleme solüsyonu çekin. Yükleme solüsyonu içeren pipet ucunu nazikçe doldurma pipetinin içine yerleştirin.

Karışımı doğrudan sinir güdüğüne püskürtün. Dolum pipetinin açık ucunu Vazelin ile sızdırmaz hale getirin. Petri kabına az miktarda solüsyon ekleyin.

Hazırlığı oda sıcaklığında, karanlık ve nemli bir yerde beş saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon işleminin ardından hazırlığı alın ve yükleme çözeltisi içeren dolum pipetini çıkarın. Hazırlığı bir banyoya yerleştirin ve Ringer çözeltisi ile yıkayın.

Hazırlığın bulunduğu banyoyu bir gece boyunca sekiz derece Celsius sıcaklıktaki buzdolabında bekletin. Dokuyu mikroskopi için hazırlayın. Hazırlığı banyodan çıkarın.

Gümüş kaplı bir hazne içinde montaj hazırlığını yapın ve dokuyu hafifçe gerin. Dokuyu taze Ringer çözeltisi ile durulayın. Vakum Stimülasyon Elektrodunu alın.

Stimülasyon Vakum Elektrodunu, ucu sinirin kesik ucuna yakın olacak şekilde hazneye yerleştirin. Siniri elektroda doğru çekin. Elektrodun yapımı Khazokoff'un makalesinde açıklanmıştır; makalenin bağlantısı materyaller kısmında yer almaktadır.

Hazırlama haznesini mikroskop tablasına sabitleyin. Sıcaklık probunu yerleştirin. Hazırlama haznesindeki Peltier elemanı için güç kablosundaki giriş tüplerini bağlayın.

Çıkış tüpünü hazırlama haznesine yerleştirin. Perfüzyon pompasını çalıştırın. Sıcaklık kontrol ünitesini açın.

Kontrol ünitesindeki sıcaklığı 20 °C olacak şekilde ayarlayın. Ultraviyole koruma kalkanını takın. Stimülatör üzerindeki gecikme süresini ve periyodu ayarlayın.

Vakum elektrodu ile stimülatör arasına bir tel bağlayın. Cihazı açın. Düşük büyütmeli bir objektif altında, stimülasyonu başlatarak kas kasılmasını kontrol edin.

Perfüzyon sistemini düşük kalsiyumlu ve yüksek magnezyumlu bir Ringer çözeltisi ile doldurun. Perfüzyon hızını dakikada yaklaşık iki mililitreye ayarlayın. Objektifi 40 kat büyütme ile değiştirin.

Polychrome V.Select emisyon dalga boyunu ve sürekli mod aydınlatmasını açın. Deklanşörü açın. 40 kat büyütmeli objektif altında, floresan mod aydınlatmalarında terminallerin yüklendiğinden emin olun.

Terminali bulun ve ona odaklanın. Yüklü sinir ve iyi yüklü motor sinir terminalleri şekilde gösterilmiştir. Görüntü yakalama işlemi Red-Short Neuro CCD Kamera ile gerçekleştirilmiştir.

Turbo-SM Yazılımını çalıştırın. Değiştir Ayarlar (Change Settings) seçeneğini belirleyin. Kare sayısı girişi olarak 500 değerini girin.

Deney adını giriniz. Temel konfigürasyon saniyede 1000 kare ve 80 x 80 çözünürlüktür.

Harici tetikleyiciyi seçin. Tetikleme öncesi süreyi girin. Eksi on milisaniye.

Tekrar sayısını 20 olarak girin. Polychrome yazılımında, harici tetikleme aydınlatma modunu seçin. Clampex yazılımını çalıştırın.

Stimülasyon protokolünü yükleyin. Protokol, Kazan Federal Üniversitesi web sitesindeki laboratuvar sayfamızdan indirilebilir. Kayda başlamadan önce Turbo-SM yazılımında bir karanlık kare (dark frame) yakalayın.

Trinoküler küp üzerinde ışık yolu değişim seviyelerini seçin. Kamera için yüzde 100'ü belirleyin. Stimülasyon protokolünü çalıştırın.

İlgi bölgesini seçin ve sinyali kontrol edin. Sinir stimülasyonuna yanıt olarak, sinir ucuna kalsiyum girişini yansıtan floresans yoğunluğu değişimini kaydederiz. Veri analizi.

Turbo-SM yazılımında, dosya (file) seçeneğini seçin. Ardından, dosyaları ortala (average files) seçeneğini seçin. Dosyaları seçin.

Ortalama dosyasının adını girin ve bunları ortalayın. Ortalama dosyayı fit dosyası olarak kaydedin. Seçin, fit dosyası olarak kaydedin.

Dosya adını girin ve kaydedin. Image J'yi çalıştırın ve aşağıdaki araçları açın: Analiz, araçlar, ROI Manager.

Fit formatında kaydedilmiş ortalama dosyayı bulun. Dosyayı Image J'ye sürükleyip bırakın. Daha iyi bir görünüm için pencereyi yakın. Arka plan olduğunu düşündüğünüz alan üzerinde dikdörtgen bir ilgi alanı seçin.

Bunu ROI yöneticisine ekleyin. ROI yöneticisinde, "more" (daha fazla) seçeneğini, ardından "Multi-measure" (Çoklu ölçüm) seçeneğini belirleyin. Ortalama değerleri yükleyin.

Verileri kopyalayın ve Excel'e aktarın. Excel'de, bir oran için arka planın ortalama değerini hesaplamak amacıyla ortalama (average) fonksiyonunu kullanın. Excel'i kapatmadan Image J'ye geri dönün. Arka plan hesaplamasının yapıldığı pencereyi kaydetmeden kapatın.

ROI Manager'ı kullanarak dikdörtgen arka plan çizimini silin. Cihaz işlem (instrument process) menüsünden matematik (math) ve çıkarma (subtract) seçeneklerini açın. Excel'den hesaplanan ortalama eşik değerini girin ve arka planı yığınlardan çıkarın.

Bir sinir terminalinin etrafında dikdörtgen bir ilgi alanı (ROI) seçin. Bunu ROI Yöneticisine ekleyin. ROI Yöneticisinde, more, Multi-measure, load down, mean seçeneklerini belirleyin.

Excel penceresine kopyalayıp yapıştırın. Excel cihaz plot grafiğini kullanın. Sinyal başlamadan önce düz bir alan seçin.

Grafiği, dinlenme halindeki ilk floresan değerlerinden sinyalin başlangıcına kadar olan ayrıntılarla doldurun. Ardından, dinlenme floresan değerlerini ortalamak için kullanılacak nokta sayısını belirleyin. Bu değerlerin ortalamasını alın, daha sonra dinlenme halindeki floresan değerinin ortalamasını bulun.

Sinyalleri dinlenme halindeki floresansa bölün. Bir çıkarın ve yüzde 100 ile çarpın. Sinyali grafiğe dökün ve kalsiyum transient genliğini hesaplayın.

Floresans sinyallerinin zaman parametreleri, kalsiyum-boya-kompleks oluşumunun ileri ve/veya geri tepkimelerinin hızına bağlıdır. Kalsiyum sinyalinin yükselme süresi, kalsiyum girişinin dinamiklerini temsil eder. Bu, kalsiyumun terminaldeki difüzyonunu ve boya ile olan etkileşimini yansıtır.

Kalsiyum transiyentinin sönümlenmesi, boya afinitesine, kalsiyum tamponlama hızına ve kalsiyumun geri çekilmesine bağlıdır. Kalsiyum transiyenti amplitüd analizi, farklı aktif maddelerin nörotransmitter salınımında rol oynayan kalsiyum girişine olan etkisini incelemek için kullanılabilir. Bu yükleme tekniği,le sitozomal kalsiyumdaki değişimlerin görüntülenmesi için oldukça uygundur.

Floresan indikatörler ile hem tekli sinir stimülasyonu hem de ritmik sinaptik aktivite kullanılarak analiz yapılır. Kalsiyum geçici genlik analizleri, nörotransmitter salınımında rol oynayan kalsiyum girişine farklı maddelerin etkisini incelemek için kullanılabilir. Dikkat çekmek istediğimiz bazı önemli noktalar bulunmaktadır.

İnkübasyon prosedürü iki adımdan oluşur: oda sıcaklığında inkübasyon ve buzdolabında inkübasyon. Boya ile oda sıcaklığında yapılan inkübasyon süresinin kontrol edilmesi önemlidir.

Sinir güdüğünün uzunluğuna, kullanılan boyaya ve oda sıcaklığına bağlı olarak inkübasyon süresi değişiklik gösterebilir. Preoperasyon terminallerini aşırı maruz bırakırsanız, sinir güdüğüne yakın proksimal kısımlar aşırı yüklenebilir. Buzdolabındaki uzun süreli inkübasyon sayesinde boya, sinir uçları boyunca eşit şekilde dağılır.

Boyanın sinire girmesini sağlamak için, kesimden sonra birkaç dakika içinde sinirin boya yükleme solüsyonuna yerleştirilmesi esastır; çünkü daha uzun zaman aralıkları, muhtemelen kapanan sinir nedeniyle etkisiz yüklemeye yol açmıştır. Boya kompartmanlaşmasını azaltmak için boyanın genişletilmiş formu kullanılabilir. Dokunun sağkalımını etkilediği için, dokunun uzun süre floresan ışığa maruz kalmasını önlemek çok önemlidir.

Terminalleri aramak için görünür ışık kanalında Nomarski optikleri kullanıyoruz. Kayıt sırasında, aydınlatılmış alanı diyafram ile sınırlıyoruz. Yükleme işleminin uzun süresi, sinirin shutter damgası kullanılarak azaltılabilir.

Bu durumda, cam mikro-bypass kullanılabilir.