Name: Onderzoek van Host Phenotypes in Gambusia affinis Na een behandeling met antibiotica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Ontdek hoe antibiotica de microbioom van Gambusia affinis verstoort en de gezondheid van de gastheer beïnvloedt. Deze methode biedt inzicht in niet-invasieve technieken voor microbioomonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door een FAST (Faculty and Student Team) Award aan TPP en JMC van EURECA (Centrum voor het verbeteren van onderzoekservaringen en creatieve activiteiten voor bachelorstudenten) aan de Sam Houston State University.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van IACUC protocollen, genummerd 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 en 14-04-17-1018-3-01. 1. Dierlijke Collection, Handling, en ethische zorg <ol><li> Verzamel Gambusia affinis uit het veld website (identificatie gids op http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) met behulp van een kleine dip net en plaats in een 19 L emmers. Gebruik visuele inspectie om soorten te identificeren. </li><li> Rest vis voor 1-2 d in een emmer met vijverwater. Daarna overdracht vis in 76 of 189 L aquarium tanks gevuld met een half vijverwater / half kraanwater bij 25 ° C, belucht met een borrelende luchtsteentje. Gebruik een kleine dip net bij het omgaan met vis als om hun huid microbiome minimaal verstoren. LET OP: Fish dichtheid mag niet hoger zijn dan 20 vis / 38 L aquariumwater zijn. Vissen worden gewend aan het aquarium minstens 5 d voor experimenten. </li><li> Voeden vis op een dagelijkse regime met 5 mg vlok voedsel per vis. Hold vis met een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. </li></ol> 2. De eerste antibiotica blootstelling voor alle experimenten <ol><li> Tekenen van alle vis uit elk experiment uit hetzelfde aquarium, te plaatsen in twee aparte groepen (behandeld: blootgesteld aan antibiotica &amp; control: onbelichte) in 19 L emmers. Vorige verzamelde gegevens blijkt dat vissen in dezelfde aquarium huid microbiomes dat er weinig variatie in de gemeenschap samenstelling hebben gehomogeniseerd. 12 </li><li> Tijdens experimenten, blijven vissen in 2 L van kunstmatige vijver water (APW; 0,33 g / l CaCl2, 0,33 g / l MgSO4, 0,19 g / l NaHCO3), die wordt gesteriliseerd in een autoclaaf voor gebruik. </li><li> Bereid de rifampicine antibioticavoorraadoplossingen door toevoeging van 50 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO). Rifampicine is een representatief breed-spectrum antibioticum dat niet giftig voor de vissen. Bij mensen en muizen, verdeelt en in de weefsels. </li><li> Vanuit de rifampicine voorraad te beheren een definitiefconcentratie van 25 ug / ml in 2 L van APW antibiotische blootstelling van de behandelde vis groep 3 dagen. Merk op dat na 3 d, huid kweekbare bacteriën M weer gelijk aan die van voorbehandelde vissenhuid. </li><li> Tegelijkertijd houden van onbehandelde vis in APW en geven een equivalente hoeveelheid DMSO (0,5 ml per liter APW) in de waterkolom te treden als een controlegroep. </li><li> Zoals experimenten beogen effecten van een antibioticum veranderd microbiome vis fenotypes te meten, om de effecten direct van het antibioticum zelf voorkomen na de driedaagse antibioticum blootstelling (controle) periode overdracht vis in een emmer met 2 L van verse APW. <ol><li> Gebruik een 10 uur rusttijd zodat het antibioticum wordt verwijderd door de organen van de vis. Baseren eliminatietijd experimenten waarin vissen werden blootgesteld aan 25 ug / ml antibioticum gedurende drie dagen. Euthanaseren de vis door te knippen het ruggenmerg, gevolgd door pithing, dan homogeniseren het hele lichaam met behulp van een tissue slijpmachine.</li><li> Bepaal antibiotische aanwezigheid door het plaatsen van 50 ul van deze suspensie na 0,2 urn filter in het midden van de agar petrischaal. Maak een gat voor deze schorsing door het indrukken van een omgekeerde steriele 200 pi pipet tip in de agar, die een kleine stekker verwijdert. </li><li> Gebruik agarplaten met 20 ml afgemeten hoeveelheid van nutriënt agar en gelijkmatig met een wattenstaafje met een indicator organisme, Bacillus subtilis, die gevoelig is voor rifampicine. Haal de B. subtilis uit een nutriënt agar geïncubeerd bij 25 ° CO / N en met het wattenstaafje een kolonie te verkrijgen. Waarnemen van een zone van remming na overnacht incubatie bij 25 ° C geeft de aanwezigheid van antibioticum in het visvlees. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extraction <ol><li> Extract huid microbiome monster van het buitenste mucosale epidermis door het plaatsen van de vis in een steriele 15 ml conische buis gevuld met 2 ml steriele PBST (137 mM NaCl, 10 mM fosfaat, 0,1% Tween-20, pH 7,4) oplossing en vortexen bij een instelling van 10 gedurende 1 min 10 s in stappen pauzeren. Wasmiddel en zout in de buffer zorgt voor een gelijkmatige verspreiding van bacteriën in oplossing. Vergelijkbare resultaten werden gevonden met 0,85% zoutoplossing, maar verlaagde bacteriële telt met zuiver water. </li><li> Breng de vis uit de conische buis op een herstel emmer. Dodelijkheid van de huid extractie is meestal lager dan 10%. Ofwel, analyseren de bacteriesuspensie in de buis onmiddellijk na extractie of pellet de bacteriën door 2 min centrifugeren in een centrifuge bij kamertemperatuur bij 15.000 xg en bewaar bij -80 ° C voor latere analyse. Let op: alle cultuur en biochemische analyses zijn onmiddellijke; DNA of eiwit-extractie kan uit bevroren monsters. </li><li> Om een gut microbiome monster te verkrijgen, eerst de vis te plaatsen in een steriele petrischaal. Euthanaseren de vis door het doorsnijden van de cervicale ruggenmerg direct achter het hoofd met chirurgische schaar, gevolgd door pithingEn vervolgens extern ontsmetten het lichaam met 70% ethanol doekjes. </li><li> Na dissectie, verwijder de hele darm door te snijden na de slokdarm en voor de anus. </li><li> Snij de darm in kleine secties 1-2 mm in de lengte en plaats alle lagen in twee ml PBST oplossing in een conische buis. Na vortexen gedurende 1 min, verwijder supernatant in een andere schone buis (neem voorzichtig om niet het opstellen van de darm secties). Opmerking: Het supernatant bevat geëxtraheerd darmbacteriën die ofwel kunnen worden gebruikt voor directe analyse of gepelleteerd door De genoemde huidmonsters vorige methode. </li></ol> 4. Besmetting Model Voorbereiding en Bath van een specifiek Pathogeen <ol><li> Het verkrijgen van een besmettelijke stam van Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) en hou de cultuur bewaard bij -80 ° C. Strain 93-146 gebruikt in deze studie, geïsoleerd van een besmette meerval, werd verkregen van Mark Lawrence, College of Veterinary Medicine, Mississippi State University. </li><li> Streak E. ictaluri voorraad op een selectieve en differentiële media genoemd E. ictaluri media (EIM) agar 19 tot en cultuur van de bacteriën en incubeer gedurende 2 dagen bij 27 ° C. </li><li> Transfer zuivere geïsoleerde kolonie van de kweek en enten een 150 ml kolf die 40 ml voedingsbodem (NB; 5 g / l pepton, 4 g / l vleesextract). Cuvette in een schudapparaat ingesteld op 150 rpm gedurende 2 dagen bij 27 ° C. </li><li> Na incubatie, verdun een monster van de cultuur in PBST een spectrometer lezing van 0,2 OD bij 650 nm E. ictaluri cultuur kalibreren gewenste infectieuze dosis volumes. </li><li> Volgende overdracht zowel behandeld (na 3 d van antibiotica blootstelling) en onbehandelde vis groepen in afzonderlijke plastic bekers met daarin 130 ml vers kunstmatige vijver water of APW gedurende ongeveer 10 uur voor de goedkeuring van geneesmiddelen uit vis weefsels. </li><li> Dan wordt uit beide groepen, de overdracht weer elke vis in 8-ounce plastic bekers met daarin 130 ml schoon APW. </li&gt; <li> Geef elke vis een dodelijke dosis met 2,8 x 10 6 CFU / ml E. ictaluri cultuur in de APW (bad infectie model) en bewaar in een 27 ° C incubator gedurende 24 uur. </li><li> Na de E. ictaluri bad, breng vis afzonderlijk in nieuwe cups met 130 ml van APW. </li><li> Naar aanleiding van water vervangen, opnemen vissterfte over de duur van een week. Vissen worden niet gevoerd over deze periode. In tegenstelling meerval, Gambusia vertonen geen uiterlijke tekenen van infectie, daarom is het essentieel om letaliteit als experimentele eindpunt. </li></ol> 5. polymicrobiologische Challenge met Uitwerpselen &amp; Soil <ol><li> uitwerpselen Treatment <ol><li> Verkrijgen verse menselijke feces van een gezonde vrijwilliger patiënt die geen antibiotica heeft gekregen in de voorgaande twee weken, met steriele handschoenen en een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Bij het verzamelen, het verzamelen van fecale materie in een steriele plastic zak en vervolgens over in een steriele 15 ml conical buis. Maak een voorraad concentratie van schorsing van uitwerpselen in PBST om een ​​voorraad oplossing van 500 te geven - 800 mg / ml. Deze dikke mengsel best overbrengen met een 1 ml of grotere plastic pipetpunt die onderaan stuurde met steriele scharen zodat de opening groter. </li><li> Na de initiële antibiotische blootstelling van behandelde en onbehandelde groepen vis, scheiden in afzonderlijke plastic cups fecale suspensie in eindconcentraties van hetzij 15 mg / ml of 10 mg / ml in APW met een totaal volume van 130 ml. Houd bekers in een incubator bij 25 ° C. </li><li> Record vissterfte tijdens fecal blootstelling door nauwe observatie over 2 d. </li></ol></li><li> Soil Treatment <ol><li> Verzamel 1-2 kg van de rijke organische bovengrond (moet de hoogste dichtheid en diversiteit van microben bevatten) ongeveer 7-15 cm in de diepte en plaats in een schone plastic container. Merk op dat de bodem moet worden gebruikt binnen twee dagen na de verzameling. </li><li> verschrikkelijkctly na de eerste periode de blootstelling, scheiden beide groepen antibiotica behandelde en onbehandelde vis in individuele plastic bekertjes met 18,2 g van de bodem in 130 ml van APW. Meng de bodem in het water goed met de hand voor het toevoegen van de vis. De meeste van de deeltjes niet schorten en verblijf in de bodem van de beker. </li><li> Expose vis voor een duur van 3 dagen bij 25 ° C en sterfte opnemen. </li></ol></li></ol> 6. osmotische stress Challenge <ol><li> Na behandeling gevolgd door een 10 h rusttijd zoals hierboven beschreven, individualiseren vis in aparte bekers bevattende NaCI bij 17,5 mg / ml (300 mmol) in 150 ml APW. Dit is de helft van de gemiddelde zoutgehalte van zeewater, strookt niet altijd dodelijk (&lt;50%) voor vis controleren, maar sterk belastend, dat effectieve osmoregulatie. </li><li> Let op voor vissterfte over een duur van 36 uur. </li></ol> 7. Nitraat toxiciteit Challenge <ol><li> Rest vis voor een 10 uur periode na antibiotica expoure, en vervolgens gescheiden in afzonderlijke vis cups natriumnitraat een concentratie van hetzij 10 mg / ml (118 mM) of 17,5 mg / ml (206 mmol) in 130 ml APW. </li><li> Record voor sterfte meer dan 4 d voor lage dosis en 1 d voor een hoge dosis. </li></ol> 8. De groei analyse van geïndividualiseerd of gegroepeerde Fish <ol><li> Volledige blootstelling antibioticum of controleperiode 3 d als groepen in emmers. </li><li> Voor Individuele, vul 8-oz piepschuim cups met 150 ml APW elk, dragen een afzonderlijke vis in de beker en neem het totale lichaamsgewicht voor de eerste beoordeling. <ol><li> Herhaal dit voor alle vissen in zowel behandelde en onbehandelde groepen. Gebruik witte Styrofoam kopjes in plaats van heldere plastic bekers, omdat vis niet te eten wanneer in het heldere cups. </li></ol></li><li> Voeden vis per dag bij de standaard dieet van twee pellets per vis. Pellets werden gebruikt in plaats van vlokken, omdat pellets hebben lage variantie in individuele massa (3,53 ± 0,42 mg per stuk, of 8% variatie), resulting in vis ontvangen van soortgelijke hoeveelheden voedsel. Monitor consumptie door visueel opnemen van niet opgegeten pellets. Consumptie prijzen waren meestal boven de 80%. </li><li> Aan het einde van elke week gedurende 4 weken, bepaald gewicht vis. Bereid een nieuwe cup met verse APW, te plaatsen op een evenwicht, en vervolgens opnemen van het gewicht. Dan, giet er een vis in een dip net uit de originele beker en de overdracht naar de nieuwe beker, die vervolgens weer wordt gewogen. Vissen worden niet behandeld om stress te vermijden. </li><li> Voor groepen, plaatsen 2 L van APW in een 19 L emmer en tarra de schaal. Houd vissen samen in beide groepen bij het overbrengen naar nieuwe APW emmers vervolgens opnemen totaalgewicht groep. Record vis groep gewicht elke week meer dan een maand tijdspanne door de overdracht naar een nieuwe emmer. </li></ol> 9. Gut Transit Time <ol><li> Gebruik fluoresceïne-gelabelde 70 kDa anionische dextran. Dextraan is geen significant verteerd en te groot om te worden geabsorbeerd in de darmen laag, waardoor passage doorgangstijd door de darm te meten.Gelabeld dextran werd opgenomen in visvoer. </li><li> In een steriele 1,7 mL buis, voeg 360 ul steriel gedeïoniseerd water en 52 mg gelatine (13% oplossing) en plaats de buis op een 60 ° C warmteblok totdat de smelt en gelatine volledig is opgelost. <ol><li> Grind goud vis eten flakes tot een fijn poeder met een mortier en stamper en voeg 40 mg van dit poeder aan de buis, samen met 20 ul van visolie. Na mengen wordt met 1,6 mg FITC-dextran. </li></ol></li><li> Verdeel de hete vloeistof mengsel in 20 pl druppels op Parafilm op de labtafel en laat ze snel afkoelen en stollen. Druppels kunnen worden bewaard tot 4 d voordat ze te moeilijk voor vis te eten geworden. WINKEL druppels in de koelkast Door de Parafilm op helft van een petrischaal, dat vervolgens wordt geïntroduceerd op steriel water in een afgesloten kunststof, de druppels bevochtigd houdt. </li><li> Net voor het voeden, druppels kwartaal in secties met behulp van een scheermesje. Acclimatiseren de vis aan de Styrofoam cups afzonderlijk voor 2 dagen zonder voeden (Let op: alleen onbelichte controle vissen werden gebruikt). Plaats vier kwartalen van het voedsel in de beker met de vis, en let op de vis voor 30 minuten voor hoeveel stuks van het voedsel dat ze elk eten. </li><li> Om de controleperiode begint, over te dragen vis afzonderlijk in kopjes met 80 ml van APW met behulp van een dip net. Elke 2 uur zachtjes wervelen de APW met de hand, en neem dan een 1 ml monster en op te slaan in een gelabelde 1,7 ml buis bij 4 ° C. Monsters te nemen voor 36 uur. </li><li> Fluorescentie plaat, met een fluorescentie spectrofotometer, van alle monsters tegelijkertijd na voltooiing van de test. Plaats het gehele 1 ml monster in een cuvet en de fluorescentie gemeten met excitatie bij 495 nm en emissie bij 520 nm op te nemen. </li></ol>

<ol><li>Panda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-Term+Effect+of+Antibiotics+on+Human+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota.</a> PloS ONE. 9 (4), 95476(2014).</li>
<li>Perez-Cobas, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+disturbance+during+antibiotic+therapy%3A+a+multi-omic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach.</a> Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+metabolic+interactions+between+the+gastrointestinal+tract+and+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517, 205-208 (2015).</li>
<li>Sekirov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-Induced+Perturbations+of+the+Intestinal+Microbiota+Alter+Host+Susceptibility+to+Enteric+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection.</a> Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).</li>
<li>Looft, T., Allen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+effects+of+antibiotics+on+mammalian+gut+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes.</a> Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).</li>
<li>Magnadottir, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15950491">Innate immunity of fish.</a> Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).</li>
<li>Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mucosal+immune+system+of+fish%3A+the+evolution+of+tolerating+commensals+while+fighting+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens.</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).</li>
<li>Nunes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Effects+of+Tetracycline+Exposure+in+the+Freshwater+Fish+Gambusia+holbrooki%3A+Antioxidant+Effects%2C+Neurotoxicity+and+Histological+Alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Contam+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations.</a> Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).</li>
<li>Fryxell, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+ratio+variation+shapes+the+ecological+effects+of+a+globally+introduced+freshwater+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish.</a> Proc Biol Sci. , 22(2015).</li>
<li>Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074930">Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure.</a> Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).</li>
<li>Leonard, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://file.scirp.org/pdf/AiM_2014051916164703.pdf">The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective.</a> Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).</li>
<li>Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+effects+of+Gambusia+affinis+with+an+antibiotic-disrupted+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).</li>
<li>Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+bioluminescence-based+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).</li>
<li>Hawke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edwardsiellosis+caused+by+Edwardsiella+ictaluri+in+Laboratory+Populations+of+Zebrafish+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio.</a> J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).</li>
<li>Petrie-Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Zebrafish+Danio+rerio+as+a+Model+for+Enteric+Septicemia+of+Catfish+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aquat+Anim+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC).</a> J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).</li>
<li>Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).</li>
<li>Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+changes+in+salinity+and+temperature+on+routine+metabolism+and+nitrogen+excretion+in+gambusia+%28Gambusia+affinis%29+and+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio).</a> Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).</li>
<li>Shotts, E. B., Waltman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+medium+for+the+selective+isolation+of+Edwardsiella+ictaluri%5BTitle%5D)+AND+%22J+Wildl+Dis%22%5BJournal%5D)">A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri.</a> J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from:
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Vilz, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Assessment+of+Intestinal+Motility+and+Gut+Wall+Inflammation+in+Rodents%3A+Analyses+in+a+Standardized+Model+of+Intestinal+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation.</a> J Vis Exp. (67), e4086(2012).</li>
<li>Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sommige uitdagingen vereisen een rustperiode in schone APW na behandeling met antibiotica voor de drug te worden uitgeput in vis weefsels. Indien de rusttijd wordt overgeslagen dan antibioticum aanwezig kan verwarren de resultaten, vooral wanneer de bepaling omvat blootstelling aan bacteriën. Om de effecten van een veranderde microbiome samenstelling zonder grote veranderingen in het aantal microben op de host, voorlopige experimenten controle microbiome samenstelling (16S profiling of volledige genoomsequenties) en bev...

Er is vastgesteld dat antibiotica het menselijk microbiome leidt tot dysbiosis kunnen verstoren, wat betekent dat een microbiële gemeenschap onbalans. Compositionele veranderingen microbiota na antibiotica is aangetoond dat de diversiteit van de gemeenschap te verlagen, verlagen belangrijke leden, en veranderen door metabolisme, met name in de darm 1, 2. Antibioticum verstoring van de darm microbiome kan kolonisatieweerstand verminderen Clostridium difficile 3, 4 en 5 Salmonella. Daarnaast is de verstoring van de microbiota in verband gebracht met de ontwikkeling van vele syndromen en ziekten bij mensen (bijvoorbeeld met antibiotica geassocieerde enterocolitis, ontstekingsdarmziekte, stofwisselingsziekten, enz.). Antibiotica worden ook op grote schaal toegepast in de landbouw als groeibevorderaar invee en pluimvee productie 6. Het gebruik van deze krachtige instrumenten niet zonder neveneffecten, die blijkt uit de snelle opkomst van antibioticaresistentie, evenals de effecten van een verstoorde microbiome heeft met bewoonde gastheer. Vele studies hebben aangetoond dat breed-spectrum antibiotica heeft langdurige gevolgen voor de structuur en functie van de microbiota, maar de bijwerkingen van een antibioticum verstoord microbiome invloed ontvangende fysiologie alleen beschouwingen die nog moeten worden ondersteund. Het samenspel tussen de gastheer, microbiota, en antibiotica is nog lang niet begrepen in een bondige wijze. Een eenvoudig en soepel model voordelig om licht te werpen op de zeer complexe zoogdiersysteem. Mucosale oppervlakken bij mensen, zoals de darm, haven de hoogste dichtheid en diversiteit van microben, en ook de meest intieme microbe-gastheer interacties. De mucosale huid microbiome vis aanbiedingen several voordelen als een modelsysteem. De Teleostei (beenvissen) is één van de eerste lijnen divergeren in de zin dat teleosten vertebraten zowel aangeboren en verworven immuunsystemen die samen geëvolueerd relatie commensale bacteriële 7. Vissenhuid deelt vele eigenschappen met type 1 mucosale oppervlakken van zoogdieren, zoals fysiologische functies, immuniteit componenten en een opstelling van slijm producerende cellen 8. De externe locatie van de vis huid slijmvliesoppervlak biedt een microbiome makkelijk te manipuleren en experimenteel monster. De Westerse mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), is een model vis die is gebruikt in het verleden voor het bestuderen van de paring en toxicologie 9, 10, 11. Gezien de geringe omvang, de bevolking overvloed in het wild als een invasieve soort, m<html> inimal zorg kosten en winterharde de natuur, hebben we G. Affinis ontwikkeld als een mucosale microbiome model. Verder Gambusia delen de fysiologie van de bevalling jong met levendbarende zoogdieren, dat is ongewoon in vissoorten te leven. We voltooiden de meest uitgebreide studie op het moment van vissenhuid normale microbiota met behulp van 16S profileren met Gambusia 12. Verdere werkzaamheden aangetoond drie negatieve effecten op de host na verstoring van de huid en de darmflora met behulp van een breed-spectrum antibioticum 13. Vijf verschillende effecten werden in de vis volgende antibiotica blootstelling onderzocht. De meest gevestigde gastheer voordeel van de microbiome concurrerend uitsluiting van pathogenen. De vis ziekteverwekker Edwardsiella ictaluri is bekend dat uitbraken van enterische bloedvergiftiging veroorzaken commerciële meerval landbouwbedrijven 14. E. ictaluri is ook aangetoond dat dodelijk infecteren zebravisclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 en 17 Gambusia. Een probleem met dit pathogeen uit de waterkolom kan dienen als een maat voor uitsluiting. Als vergelijking gevoeligheid voor individuele pathogeen, werd overleving bij blootstelling aan een hoge dichtheid van gemengde organismen ook uitgevoerd. Uitwerpselen en organisch-rijke bodem werden gebruikt als veelvoorkomende bronnen van microbiële gemeenschappen. Een andere gevestigde rol van de bacteriële darm gemeenschap voert is voedingsstoffen verwerken en energie oogsten, hetgeen van invloed van de algemene nutritionele opname voor de gastheer. Als een grove meting van de voeding, werd vis lichaamsgewicht vergeleken vóór en na een maand van te worden gevoed met een standaard dieet. Antibiotica behandeld vis als een gemiddelde verloren gewicht, terwijl de controle vis gemiddeld gewicht gekregen over de maand. Het mechanisme voor dit gebrek aan gewichtstoename onduidelijk. Een mogelijke factor is transittijd van voedsel in de darm. Een GI motiliteit methode werd aangepast van de zebravis (Adam Rich, SUNY Brockport, persoonlijke communicatie) om de doorvoer te bepalen. Het is nog niet vastgesteld of antibiotica behandeld vissen hebben een veranderde transittijd. Een gemeenschappelijke uitdaging in de natuurlijke omgeving ervaren door alle organismen, met name vissen, is osmotische stress. Gambusia bleken zich snel aanpassen aan acuut benadrukt in hoge concentraties zoutgehalte 18. Verrassend, vissen met een antibioticum veranderd microbiome tentoongesteld verlaagd overleven op een hoog zout stress. Het mechanisme voor dit nieuwe fenotype wordt onderzocht. Een andere veel voorkomende op aquatische dieren, met name in aquaria, is giftig vormen van stikstof (ammoniak, nitraat en nitriet). Survival nitraat was niet significant verschillend tussen antibiotica behandelde en controle vis. De in dit manuscript werkwijzen kunnen worden gebruikt met Gambusia of soortgelijke vis modelorganismen, zoals zebravis en medaka, om fenotypen in de vis volgende experimentele manipulatie te meten.

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne-gelabeld 70 kDa anionisch dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>tabletten oplossen in water om PBS te maken</td></tr></tbody></table>

onderzoek van host phenotypes in<em&gt; gambusia affinis</em&gt; na een behandeling met antibiotica

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

De veelvuldige toepassing van antibiotica in de geneeskunde betekent dat het begrijpen van de resulterende gevolgen voor de gastheer van vitaal belang is. Antibiotica verminderen vaak de diversiteit van de microbioomgemeenschap van de gastheer en veranderen de samenstelling van de microbiële gemeenschap. Veel ziekten zoals antibiotica-geassocieerde enterocolitis, inflammatoire darmziekte en metabole stoornissen zijn gekoppeld aan een verstoord microbioom. De complexe wisselwerking tussen gastheer, microbioom en antibiotica vereist een hanteerbaar model voor het bestuderen van gastheer-microbioom interacties. Onze zoetwaterwerveldiervis dient als een nuttig model voor het onderzoeken van de universele aspecten van de structuur en functie van het mucosale microbioom, evenals het analyseren van gevolgde gastheerefecten door het veranderen van de microbiële gemeenschap. Methoden omvatten gastheeruitdagingen zoals infectie door een bekende vispathogeen, blootstelling aan fecale of bodemmicroben, osmotische stress, nitraattoxiciteit, groeianalyse en meting van darmmotiliteit. Deze technieken demonstreren een flexibel en nuttig modelsysteem voor snelle bepaling van gastheerfenotypen.

Een algemeen schema van het experimentele systeem om vis ontvangende effecten van antibiotica blootstelling 13 studie is weergegeven in figuur 1A en omvat de techniek voor het extraheren van de huid (Figuur 1B) en dierlijke (figuur 1C) microbiomes uit de vis. Drie dagen werd geselecteerd als het antibioticum periode van blootstelling omdat eerdere gegevens blijkt dat, terwijl de totale huid kweekbare aantal in het...

Deze studie omvat werkwijzen effecten op een modelvis gastheer na verandering van de huid en darmen microbiome gemeenschappen compositie van een antibioticum onthullen.

Onderzoek van Host Phenotypes in<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Na een behandeling met antibiotica

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Het algemene doel van dit experimentele systeem is om de negatieve bijwerkingen voor een gastheerorganisme na een antibioticabehandeling te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van het microbioom, zoals bijwerkingen gerelateerd aan antibiotica op de gezondheid van de gastheer die worden veroorzaakt door een verstoord microbioom. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het systeem eenvoudig en goedkoop is voor het onderzoeken van fysiologische fenotypes van gewervelde gastheren, en dat het een niet-invasieve verstoring van het mucosale microbioom mogelijk maakt.De implicaties van deze techniek karakteriseren hoe een verstoring in het microbioom van een dier kan leiden tot grote bijwerkingen. Begin met het uitstrijken van een eerder verkregen en ingevroren infectieuze stam van Edwardsiella ictaluri op E.Ictaluri selectief en differentieel medium agar. Incubeer de cultuur gedurende twee dagen bij 27 °C.Transfereer een zuivere geïsoleerde kolonie van de cultuur en inoculeer een kolf van 150 milliliter met 40 milliliter nutriëntenbouillon. Plaats de kolf in een schudincubator bij 27 °C en 150 RPM gedurende twee dagen

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Bernut, A., et al., Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a protocol for isolating and quantifying Mycobacterium abscessus from an infected zebrafish embryo. The procedure involves embryo euthanasia, tissue lysis, and homogenization to release the bacteria, followed by centrifugation and resuspension in a surfactant buffer. Finally, the bacterial suspension is serially diluted, plated...

Isolation and Cultivation of Bacteria from Zebrafish Embryos to Assess Infection Load

Source: Le, T. A. N., et al., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a fluorescence-based assay to quantify intestinal permeability in C. elegans exposed to Pseudomonas aeruginosa. Compared to controls fed Escherichia coli, pathogen-treated worms show increased fluorophore leakage into the body cavity, indicating epithelial barrier damage.

Assessment of Intestinal Permeability in C. elegans Following Bacterial Exposure

Een ei-in-worm (EIW) test is een handige methode om eierleggende gedrag te kwantificeren. Veranderingen in eileg kan een gedragsmatige reactie van het modelorganisme...

Het meten van de effecten van bacteriën op<em&gt; C. Elegans</em&gt; Gedrag Met behulp van een Ei Retention Assay

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft het gebruik van sump swabs en slib analyse van zebravis systemen, die tot verhoogde detectie in vergelijking met het exclusieve gebruik van sentinels leidt te detecteren ziekteverwekkers zoals Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en  Pseudocapillaria tomentosa. Een systeem om te controleren van P. tomentosa eieren in quarantaine wordt ook voorgesteld.

Milieu Screening van Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. en Pseudocapillaria tomentosa in Zebrafish systemen

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Zebrafish (Danio rerio) worden een veel gebruikte gewervelde diermodel voor microbiële kolonisatie en de pathogenese. Dit protocol beschrijft het gebruik van de protozoan Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infectie in zebrafish larven. P. caudatum gemakkelijk internaliseert bacteriën en krijgen overgenomen door larvale zebrafish via natuurlijke azen gedrag.

Met behulp van de eencellige Paramecium caudatum als een voertuig voor voedsel overgedragen infecties in Zebrafish larven

Dit protocol beschrijft een Aspergillus infectiemodel in zebravislarven. Aspergillus sporen worden micro-geïnjecteerd in de hindbrain van larven, en chemische behandeling wordt gebruikt om immunosuppressie induceren. Infectieprogressie wordt gecontroleerd via een dagelijkse beeldvormingsopstelling om schimmelgroei en immuunresponsen te monitoren, evenals inventarisatie van levende sporen per kolonievormende eenheidsplating.

Infectie van zebravislarven met Aspergillus-sporen voor analyse van gastheer-pathogene interacties

Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

Er is momenteel een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infecties. Hier beschrijven we een protocol voor wondinfectie door een Pseudomonas aeruginosa klinisch isolaat om een persisterende infectie bij zebravislarven te genereren.

Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Ontdek hoe antibiotica de microbioom van Gambusia affinis verstoort en de gezondheid van de gastheer beïnvloedt. Deze methode biedt inzicht in niet-invasieve technieken voor microbioomonderzoek.

Onderzoek van Host Phenotypes in

Meer video's verkennen