Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é medir a aloreatividade das células T usando citometria de fluxo de imagem. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave na imunologia do transplante, como qual proporção das células T de um receptor é reativa aos aloantígenos do doador. Essa técnica combina os poderes de quanititação multiparamétricos da citometria de fluxo com os recursos de imagem da microscopia fluorescente para permitir o exame de alto rendimento de sinapses celulares apresentadoras de antígenos de células T individuais.

Demonstrando o procedimento estará Sajad Moshkelgosha, um pós-doutorado do meu laboratório. Comece semeando ponto zero cinco vezes 10 elevado à sexta célula dendrítica. em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços, seguida por uma vez 10 elevado às sextas células T e um volume final de até 50 microlitros de meio de cultura por poço.

Incube as culturas frias por quatro horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Em seguida, adicione três vezes o volume de cultura de um vírgula cinco por cento de formaldeído em PBS a cada poço por 30 minutos em temperatura ambiente. No final da fixação, transferir as células de cada poço para um tubo de poliestireno de cinco mililitros correspondente.

Manchar as células com os anticorpos conjugados com fluorocromo apropriados em 100 microlitros de tampão de lavagem por 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz. Em seguida, lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e ressuspenda os pellets em permanente / tampão de lavagem contendo falocidina FITC. Após mais 30 minutos em temperatura ambiente protegida da luz, lave as células em um mililitro de permanente fresco / tampão de lavagem.

Ressuspenda os pellets no corante nuclear de interesse no tampão permanente/lavagem para uma incubação final de 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. Lave as células em um milímetro de permanente/tampão de lavagem seguido de uma lavagem apenas no tampão de lavagem. Em seguida, ressuspenda as células em 50 a 100 microlitros de tampão de lavagem recente.

Transfira as células para pequenos tubos de microcentrífuga tampados. Para analisar as interações célula a célula, primeiro reserve um canal para aquisição de imagem de campo claro e carregue o primeiro tubo de controle. Com o canal de campo claro desativado, na janela do espaço de trabalho, crie um novo gráfico de dispersão para cada canal usado com a taxa de proporção sobre a área.

Insira os singlets onde a proporção é próxima de um. Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e ajuste a tensão do laser na caixa de iluminação, conforme necessário. Na caixa de canais, selecione os canais apropriados para os fluorocromos usados na coloração.

Em seguida, clique em gravar. Quando o número de eventos atingir o limite especificado, a aquisição será interrompida automaticamente. Depois que todos os controles de coloração única tiverem sido adquiridos, carregue o primeiro tubo de amostra experimental e adquira várias dezenas de milhares de eventos sob os canais de análise apropriados, incluindo o canal de campo claro.

Para gerar uma matriz de compensação, carregue os arquivos de dados de controle de coloração única no assistente de compensação e selecione os canais fluorescentes apropriados para o experimento. Depois de confirmar que as populações positivas corretas foram selecionadas, clique duas vezes em um valor na matriz e adicione o gráfico à área de análise de cada canal. Clique em concluir para salvar a matriz de compensação como um arquivo CTM.

Carregue o arquivo RIF no software de análise apropriado. Converta o arquivo RIF em um arquivo DAF de análise de dados. Abra o primeiro arquivo de amostra.

Traçar a raiz quadrada média da taxa de variação da intensidade da imagem no canal de campo claro. Em seguida, plote a proporção versus a área do marcador celular apresentador de antígeno. Ingira os dupletos contendo uma única célula apresentadora de antígeno.

Plote a proporção versus a área do marcador de célula T. Ingate nos gibões contendo uma única célula T. Para identificar as células em contato umas com as outras, no menu de análise, use a opção máscaras para abrir o gerenciador de máscaras e nomeie a nova máscara como máscara de objeto de célula T.

Clique no botão de função e, na caixa de diálogo, selecione o objeto. Selecione o canal no qual o marcador de célula T é detectado e clique em OK. Crie uma máscara para o marcador celular apresentador de antígeno no canal apropriado da mesma maneira. Plote a intensidade de fluorescência do marcador de células T na máscara de objeto de célula apresentadora de antígeno contra a intensidade de fluorescência de célula apresentadora de antígeno na máscara de objeto de célula T.

Em seguida, desenhe um portão que inclua apenas as células em contato umas com as outras. Finalmente, revise manualmente as imagens FITC de faloidina dos eventos dentro desta porta para distinguir as sinapses imunes maduras dos contatos simples célula a célula usando a função de imagens de tag para marcar essas imagens. Aqui, a porta de contato com a membrana é mostrada para células T CD4 positivas esplênicas obtidas de receptores tolerados e não tolerados de aloenxertos cardíacos B6 sete dias após o transplante e coincubados com células dendríticas derivadas da medula óssea B6, conforme demonstrado.

Com os eventos sinápticos e não sinápticos indicados pela mira verde. As análises de Brighfield e de canais fluorescentes também permitem a visualização dos eventos sinápticos e não sinápticos individuais. De fato, as sinapses de receptores de CDA não tolerados e tolerados de corações B6 são facilmente distinguidas dos contatos não sinápticos pela presença de cristas densas positivas para FITC na interface celular apresentadora de antígenos de células T.

Após um maior desenvolvimento, essa técnica pode ser aplicada em ambientes clínicos, como na redução ou retirada da imunossupressão ou na previsão do resultado do enxerto em receptores translantes humanos.