שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

היי, אני אשרא קורונה מהמעבדה של ד"ר מיץ' קרוננברג במחלקה לאימונולוגיה התפתחותית במכון לה הויה לאלרגיה ואימונולוגיה. היום אני הולך להראות לכם כיצד להכין תאי חרקים גבוהים ולהדביק אותם ב-VIR לצורך יצירת רעידות MA CD 1D. טטרים CD 1D משמשים את המעבדה שלנו ועל ידי אחרים לזיהוי תאי NKT.

מערכת VIR נמצאת בשימוש נרחב לייצור חלבונים רקומביננטיים כולל רעידות TE מסוג MS C Class II. אז להליך שיוצג לך יש תחולה הרבה יותר רחבה. הליך זה כולל התחלה וגידול של חמישה תאי חרקים גבוהים מדביקים את התאים עם ריאו-וירוס הנושא CD 1D קציר CDNA על ידי צנטריפוגה לאחר ארבעה ימים של זיהום, ליזה בריכוז החלבון במאגר נתרן פוספט 150 מילימטר, טיהור pH 7.4 של חלבון CD 1D של עכבר על ידי ניקל ו-T אגרוס ושיטת חילופי ברזל ריכוז שיטת רומה M CD חלבון G אחד ל-1 me לכל ML באמצעות רכז YM 30 כאשר הפרה אנזימטית של עכבר CD 1D על ידי פרוטוקול AVID D, ביטול BioTeam בחינם על ידי עמודה S 200.

ולבסוף, ייצור אלפא ג'ל CD 1D Tet. אמנם כל ההליך כולל את כל השלבים הללו, אך היום נראה לך רק כיצד לטפל בתאים אלה ולהדביק אותם בווירטוס במטרה ליצור רעידות CD 1D נוספות. בואו נתחיל.

קודם כל, ברצוני להראות לכם כיצד לחמשת תאי החרקים TN, קו חמשת התאים הגבוה מקורו בתאי השחלה של חרק לופר הכרוב. הם משמשים בפרוטוקול זה מכיוון שהם מגדלים ללא סרום, מדיום המותאם לתרבית תרחיף ומייצרים רמות גבוהות של חלבון רקומביננטי בחמישה מ"ל של מדיום אקספרס חרקים בתרבית רקמה מרובעת של 25 סנטימטר. לא, חמש האקספרס הזה מגיע ללא גלוטמין.

אז אנחנו צריכים להוסיף 10 מ"ל של רצועת עט גלוטמין פי מאה או גלוטמין לבד לליטר אחד של מדיה. עכשיו אני הולך לקחת את הבקבוקון הקפוא של תאי חרקים גבוהים, להפשיר את זה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, להוסיף מיד חמישה תאי חרקים גבוהים לבקבוק ולדגור במשך 30 דקות ב-27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אינקובטור שואב את המדיום כדי להיפטר מהמדיום עם DMSO בעדינות מבלי להפריע לתאים המחוברים בתחתית הבקבוק.

כעת עלינו להוסיף חמישה מ"ל של מדיום טרי לתוך ה-flas לאחר הזיהום, כעת עלינו להרחיב את התאים לפני הדבקה ב-vir. עקוב אחר התאים כל יום כאשר הבקבוק בטוח כמעט ב-70%. הביאו את התאים בתלייה על ידי דפיקת הבקבוק משני הצדדים.

העבירו את התאים לבקבוק בגודל 1 75 ס"מ מרובע על ידי הוספת 25 מ"ל של מדיום אקספרס חרקים וחמישה מ"ל של בקבוק ועידה מפוצל של תרבית תאים. אחד הוא לארבע או אחד לחמש לפי הצורך. אל תתנו לתאים לגדול יתר על המידה לספור את מספר המעברים שפיצלתם את התאים.

אל תעבור על מעבר מספר 30 מכיוון שהוא עלול לגרום להזדקנות התאים וכתוצאה מכך לליזה של תאים. יש לפצל תאים כל יומיים. אם אנחנו מתפצלים, אחד הוא לחמישה.

כאשר מגיעים לנפח הרצוי בריכוז של מיליון תאים למ"ל תאים נגועים, אני בדרך כלל מגדל עד שני ליטר, שבדרך כלל מסתכמים בבקבוק בקנה מידה של 71 סנטימטר וכ-25 מ"ל לבקבוק או ארבעה בקבוק ER ליטר וכ-500 מ"ל לבקבוק. גידול תאים בבקבוק ER הוא הרבה יותר מהיר במאה מ"ל תרבית ו -400 מ"ל של מדיום אקספרס חמישה SFM ומגדלים אותם בשייקר ב -1 25 סל"ד בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס עד שנגיע למיליון לכל מ"ל תאים בנפח הרצוי לפני הדבקת התאים, ברצוני להראות לך כיצד לקשור את נגיף הבלו ונעשה זאת בהמשך. על מנת להדק את הנגיף, יש לשחק בין 3000 ל-5,000 תאים לבאר.

ובכן בתחתית שטוחה 96 צלחת באר ב 200 מיקרוליטר של חרקים מבטאים חמישה מדיום SFM. תן לתאים להתייצב על 27 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. בצע את הדילול הסדרתי של מלאי אביוס.

אחד צריך לעשות הוא נטייה לדילול בשורה אחת של ערך 96. צלחת תחתונה באמצעות 250 מיקרוליטר לבאר. הדילולים נעשים במדיום אקספרס של חמישה SFM.

באמצעות פיפט רב-ערוצי מעבירים כמות קבועה, בדרך כלל 20 מיקרוליטר של דילולים שונים לתרבית התאים באינקובטור של 27 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים כדי למנוע אידוי משורות הקצה. עוטפים את שולי הצלחת בפיל לאחר שבעה ימים. בדוק את הצלחת וקבע איזה דילול של הנגיף נותן זיהום של 50%.

לאחר מכן השתמש בנוסחה לחישוב הטיטר, המתבטא ב-PFU למ"ל. הנוסחה נוצרת ברוב המדריכים של נגיף הבלו. לאחר טינג, הנגיף, כמות נדרשת של וירוס כדי להדביק את התאים לייצור חלבון, ריבוי ההדבקה צריך להיות בין חמש ל-10.

לדוגמה, אם הטיטר של נגיפי בלו CD 1D של עכבר הוא מאה מיליון יחידות יוצרות פלאק למ"ל ויש לנו 20 מיליון תאים לבקבוק, עלינו להוסיף מ"ל אחד עד שני מ"ל של נגיף בלו כדי להדביק את התאים. התאים צריכים להיות נגועים במשך ארבעה ימים. ביום הרביעי לאחר ההדבקה, התאים צריכים להיות מנותקים, צפים, נפוחים ויוצרים נקניק כמו כבשים.

עכשיו הגיע הזמן להחזיר את הסאפ נטנט. קח את המדיום מהעברת בקבוק נגוע לבקבוקי מסתובב של 250 מ"ל פלקון כחול. ניתן לבצע בהם חיטוי ולעשות בהם שימוש חוזר.

מלאו את הבקבוקים באופן שווה ונשלחו לזיוף התאים ברוטור GSA ב -2000 סל"ד, 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את ה-SUP natin והמשיכו לטיהור נוסף. זה עתה הראיתי לכם כיצד ליזום, לגדל ולהדביק את חמשת תאי החרקים הגבוהים ולטשטש את נגיף הבלו.

באמצעות תאים אלה, ההיבטים החשובים ביותר של הליך זה הם כיצד לשמור על התאים וכיצד לדעת את הטיטר המדויק של הבאוס. לאחר שיצרת רעידות CD 1D, הם יכולים לשמש ככלי רב עוצמה לניתוח תאי T תגובתיים גליקוליפידים. הליך זה לטיפול בנגיף הבלו יכול לשמש גם לחלבונים רקומביננטיים רבים אחרים.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.