Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

Bu prosedürün genel amacı, donma artefaktlarını ortadan kaldırırken kas dokularını doğrudan sıvı nitrojene daldırarak dondurmaktır. Laboratuvarımdan bir öğrenci olan Maozhang He, bu prosedürü Yizhong Huang ile gösterecek. Başlamak için, her bir kriyojenik şişenin üzerindeki numune kimliğini etiketleyin.

Ardından, aşağıdaki ekipmanı düzenleyin: bir sıvı nitrojen tankı, koruyucu gözlük veya yüz siperi, dondurucu eldivenleri, 10 santimetre forseps ve 25 santimetre cımbız. Ayrıca bir strafor soğutucu, plastik film, neşter ve A4 PVC ciltleme kapakları düzenleyin. Kas örnekleri hazırlamak için soğutucuyu sıvı nitrojenle doldurarak başlayın.

Bir numune aldıktan sonraki beş dakika içinde, numuneyi bir parça A4 PVC ciltleme kapağına nazikçe yerleştirin ve kas liflerinin yönünü gözlemleyin. Daha sonra, numune boyunca kas lifleri yönünde, yaklaşık 3 santimetre uzunluğunda ve 0,6 santimetre aralıklı iki paralel kesi yapmak için bir neşter kullanın. Kesilen kası yaklaşık 0,6 santimetre genişliğinde, 0,6 santimetre yüksekliğinde, 1,5 santimetre uzunluğunda bir dikdörtgen şeklinde kesin.

Daha sonra, on santimetre forseps kullanarak, numuneyi, kesilen kasın uzunlamasına ekseni filmin uzun kenarına paralel olacak şekilde bir plastik film parçası üzerine nazikçe koyun. Kas dokusunu, etiketli bir kriyojenik şişenin alt ortasına, giriş deliklerinin hemen arasına yerleştirin ve şişeyi sıkıca kapatın. Doku örneğini dondurmak için, tüm kriyojenik şişeyi önceden soğutulmuş strafor soğutucuya hızlı bir şekilde sıvı nitrojene batırmak için 25 santimetre cımbız kullanın ve sıvı nitrojen artık kaynamayana kadar bekleyin.

Sıvı nitrojen, tüm kriyoviali daldırmak için yeterli olmalı ve kriyojenik flakon tamamen sıvı seviyesinin altında olmalıdır. Kas örneklerini uzun süreli saklama için sıvı nitrojen depolama tankına veya 80 santigrat derece dondurucuya aktarın. Donmuş kaslar ile oda sıcaklığındaki kaplar veya aletler arasında kazara temastan kaçınmak önemlidir.

Slaytları hazırlamak için, bir kriyostatı 20 santigrat derece ile 22 santigrat derece arasında önceden soğutun. Eski mikroton bıçağını çıkarın ve atın ve kriyostattaki bıçak tutucuyu ve yuvarlanma önleyici plakayı silin. Ardından, kriyostata yeni bir mikroton bıçağı takın ve kesme kalınlığını sekiz mikrometreye ayarlayın.

Kas numunesi ile kriyojenik şişeyi sıvı nitrojen depolama tankından veya 80 derece santigrat dondurucudan çıkarın ve sıvı nitrojenin içine veya kuru buzun üzerine yerleştirin. Ardından, numuneyi kriyostata aktarın ve numunenin kriyostatın sıcaklığı ile dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Numuneyi gömmek için OCT kullandıktan sonra, numuneyi numune tutucuya monte edin.

Ardından, sekiz mikrometrelik bölümleri kesin. Bölümleri oda sıcaklığında bir mikro sürgünün ortasına doğru monte edin. Slaytı hemen bir slayt kutusuna yerleştirin.

Ardından, slayt kutusunu 80 derecelik bir dondurucuya koyun. Sürgünün oda sıcaklığında kurumasına izin vermeyin. Burada görüldüğü gibi, domuzlardan alınan longissimus dorsi kası örneği doğrudan 80 santigrat derecelik bir dondurucuya yerleştirildiğinde buz kristalleri oluştu ve kas kriyo-kesiti üzerinde iyi bilinen bir İsviçre peyniri etkisine neden oldu.

Buz kristalleri, kas dokusu doğrudan sıvı nitrojene daldırıldığında da oluştu. Başka bir yöntem kullanılarak, doku uygun oryantasyonda OCT montaj ortamına daldırıldığında miyoliflerin sitoplazmik bölmesinde birçok iğne benzeri buz kristali oluştu ve daha sonra bir izopentan bulamacı içinde hızla donduruldu. Dokunun çok delikli kriyoviyal içinde dondurulması, açıkça görülebilen bir sitoplazmik bölme ve miyofiberlerin çevredeki dokuya sıkı bir şekilde atanması ile mükemmel numune bütünlüğü sağlar.

Bu yöntem kullanılarak, hızlı kasılan ve yavaş kasılan kas liflerinde ATPaz aktivitesi analiz edildi. Eşdeğer süreler verildiğinde, hızlı büzülen lifler iki derece ile hafif görünür ve yavaş büzülen lifler siyah görünür. Burada gösterilen standart bir dondurma yönteminde, kas dokusu, OCT montaj ortamı ile doğrudan temas olmaksızın bir izopentan bulamacına daldırıldı, ancak izopentanın katı bir sıvı bulamaç halinin bir saatten fazla sürdürülmesi zordur ve izopentan her zaman mevcut değildir.