使用靶向 Ca²⁺ 传感器 CatchER⁺ 监测内质网/肌浆网钙释放

本实验的总体目标是展示我们使用CatchER plus对HEK293和C2C12细胞进行培养和转染的实验方案，及其在NC2KD测量中用于监测ERSR受体介导的钙瞬变的应用。该方法有助于回答钙信号传导和成像领域中的关键问题，例如特定细胞ERSR中的基础钙浓度及其快速变化，以及如何应用生物传感器CatchER plus进行此类测量。该技术的主要优势在于能够实时记录单个细胞的荧光响应，且具有快速的动力学特性。

该技术的应用前景涉及ERSR钙相关疾病的诊断，因为CatchER plus能够监测这些细胞器中由钙信号传导元件功能障碍引起的异常钙瞬变。本方法的可视化演示至关重要，因为细胞转染和荧光成像步骤较难掌握，而细胞培养和显微镜操作均存在多个易出错环节。本次实验操作将由本实验室的博士后Florence Reddish进行演示。

实验开始时，将 HEK293 细胞接种到六厘米培养皿中的无菌玻璃盖玻片上，培养一至两天，直至转染当天细胞融合度达到约 70%。接着，吸出培养皿中的 DMEM 培养基，加入三毫升低血清培养基。然后，将 DNA 转染试剂混合物加入培养皿中，在 37 摄氏度条件下孵育四至六小时。

HEK293细胞的转染通常比其他细胞系更容易，但这些细胞对严苛条件的耐受性较差。因此，必须严格控制其与转染试剂的接触时间在4至6小时以内，以避免发生凋亡。转染4至6小时后，使用5至6毫升的HBSS洗涤细胞。

弃去培养皿中的HBSS，加入3 mL新鲜DMEM。随后将细胞在37摄氏度孵育48小时，以诱导GECI表达。对于C2C12成肌细胞，加入1至2 mL胰蛋白酶覆盖培养皿底部，进行消化处理。

接下来，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育2至6分钟，以使胰蛋白酶将细胞从培养皿底部消化松解。孵育完成后，吸除胰蛋白酶，并用8毫升DMEM培养基重悬细胞。用DMEM充分吹打细胞，使其均匀分散并重新悬浮。

然后，将细胞接种到6厘米培养皿中的无菌盖玻片上，并加入3 mL DMEM，使最终汇合度达到60%。同一天进行细胞转染。在37°C下孵育24小时。孵育结束后，用5–6 mL HBSS洗涤细胞。

弃去培养皿中的HBSS，加入三毫升新鲜DMEM。随后在37摄氏度孵育48小时，以允许GECI表达。在此步骤中，打开显微镜和光源，然后启动simple PCI程序。

使用棉签在低剖面开放式钻石浴成像室底部涂上一层薄薄的密封剂。然后，从培养箱中取出含有转染细胞的载玻片，用约1毫升预热至37摄氏度、含10毫摩尔葡萄糖和1.8毫摩尔钙的林格缓冲液轻轻冲洗三次。在培养皿中保留约1毫升林格缓冲液，以防止细胞干燥，并用镊子将载玻片从培养皿中取出。

用实验室纸巾轻触载玻片边缘以吸去多余溶液。然后将载玻片放入腔室侧面，使细胞面朝向油脂。随后，使用螺丝刀将腔室固定在载物台支架上。

在将样品室安装到载物台上并完成显微镜设置的过程中，向样品室中加入约一毫升林格氏液，以防止细胞干燥。将显微镜物镜切换至40倍油镜物镜。在物镜上滴加一滴浸油。

随后，将装片置于显微镜载物台上。然后，将真空吸头放入腔室中，以保持溶液液面平稳，防止溢出。接下来，使用粗调旋钮升高物镜，直至物镜上的油接触到玻片底部。

使用明场模式，将增益调节至175，曝光时间调节至0.03秒，以聚焦细胞。待细胞聚焦清晰后，切换至荧光模式，使用488纳米激发光，并将曝光时间调整为0.07秒。选择一个视野，确保其中含有足够数量、状态健康且荧光信号充足的细胞用于成像。

然后，在荧光和明场模式下拍照。在细胞内圈定一个感兴趣区域，或圈定整个细胞，以记录所选区域的荧光强度。接着，将帧率设置为每五秒一帧，开始进行强度测量。

让基线强度稳定20到30帧。接下来，根据终体积为450微升的孵育 chamber，计算从20毫摩尔的储备液中需要加入的4-CMC量，以获得终浓度为200微摩尔。然后，小心地将60微升的任氏液从孵育 chamber 转移至微量离心管中。

将计算量的4-CMC用此溶液稀释后，重新加入培养腔，以诱发正在成像的细胞产生预期反应。给予足够时间使药物与受体结合，并导致信号下降。随后，在同时添加事件标记的同时，用3至6毫升林格氏缓冲液洗涤细胞。

针对每种检测，使用转染细胞的新载玻片，重复上述步骤，分别加入100 µM ATP和15 µM CPA。测量完成后，在simple PCI程序的强度测量窗口中结束数据采集。随后，采集细胞的荧光和明场图像。

然后，打开该实验的数据文件。如有必要，重新圈选细胞或感兴趣区域，以重新计算强度值。为确定NC2KD和C2C12成肌细胞，重复转染步骤，并在腔室中加入一毫升无钙的林格氏缓冲液。

使用含0.002%至0.005%皂苷的细胞内缓冲液对细胞进行透化处理，持续15至30秒，以清除细胞质中可能存在的任何CatchER plus。随后，用三至六毫升含有EGTA和10微摩尔离子霉素的KCl缓冲液洗涤细胞。继续观察，直至荧光强度下降并达到平台期。

随后，用 3 至 6 毫升含有 10 微摩尔离子霉素的 KCl 缓冲液冲洗细胞，并等待荧光强度稳定。之后，加入不同的钙溶液，使每次添加后荧光强度达到平台期。为校准传感器以定量基础钙浓度，使用 EGTA 和 100 毫摩尔钙缓冲液分别获得最小和最大荧光强度。

图中显示的是转染了 CatchER plus 的透化 C2C12 成肌细胞所采集的归一化强度的代表性特征。细胞在胞内缓冲液中用 0.005% 皂苷处理 15 至 30 秒以实现透化。EGTA 和钙溶液均用 KCL 缓冲液配制，N 表示成像细胞的数量。

这些插图中的荧光图像代表了处理前后细胞的典型情况。在存在10 µM离子霉素的条件下，向透化的C2C12成肌细胞中分别添加0.2、0.6、2、5、10、20、50和100 mM的钙离子，获得的KD值为3.1 ± 1.4 mM。该图显示了在分别加入1 mM EGTA和100 mM钙离子（均含10 µM离子霉素）后，转染CatchER的细胞在最小值和最大值时的代表性强度测量结果。

掌握该技术后，成像过程可在 30 至 60 分钟内完成，若包括转染步骤则需三天。在进行该操作时，务必始终在无菌环境中处理细胞，实验前准备好所有试剂，向腔室均匀涂抹一层润滑脂，并在开始前连接好真空装置。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如蛋白质印迹）来回答更多问题，例如 CatchER plus 的表达水平。

该技术开发后，为钙信号传导与成像领域的研究人员探索哺乳动物细胞内质网-线粒体接触区（ERSR）的钙动力学提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用CatchER plus技术进行细胞转染及成像操作。