Name: Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Öğrenin, fare T-hücre hatlarında kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) protokolünü. Bu yöntem, histon işaretlerinin dağılımını inceleyerek kromatin biyolojisi ve immünoloji alanlarında önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mükemmel teknik yardım için P. Käse ve T. Schmidt-Wöll&#39;e minnettarız. Bu çalışma, DFG (Alman Araştırma Vakfı )&#39;nın TRR81 ve Heisenberg programı (BO 1639 / 5-1), Freiburg&#39;daki Max Planck Topluluğu ve EXC 294 ortak araştırması hükmü ve Cardio Pulmoner Sistem için Mükemmellik Kümesi tarafından desteklendi. (ECCPS), Giessen&#39;de TB&#39;ye

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve ortam Tablo 1&#39;de listelenmiştir . Gün 1 ve 2 1. Hücrelerin Çapraz Bağlanması <ol><li> 6-kuyucuklu bir plakadan fare T-hücrelerini, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 x g&#39;de 5 dakika boyunca 50 mL tüp ve santrifüje aktarın. 30 mL IMDM hücre kültürü ortamında hücre topağını süspanse edin ve bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. </li><li> Yeni 50 mL&#39;lik tüplere 20 x 10 6 hücrelik kısımlar toplayın. </li><li> % 1 final konsantrasyona doğrudan formaldehit (FMA) hücre kültürü ortamı ekleyin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkat: FMA inhale edildiğinde toksiktir, bu nedenle duman kaputunun altında çalışın ve uygun koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, lütfen ev sahibi kurumun kurallarına göre FMA atıklarını ele alınız. </li><li> 1/8 hacim 1 M glisin, pH 7.0 ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 5 dakika süreyle santrifüj ederek hücreleri peletleyinMin, 4 ° C&#39;de ve ~ 271 xg&#39;de yıkanır ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanır. </li><li> Hücre pelletini 1 mL PBS ile yıkayın ve 1.5 mL tüplere aktarın. </li></ol> 2. Hücre Lizizi ve Kromatin Kesme <ol><li> Hücre peletini 1 mL SDS liziz tamponuna tekrar süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. </li><li> Her bir numuneyi sonikasyon tüpüne aktarın ve Tablo 2&#39;de belirtilen ayarlara göre odaklanmış bir ultrasonatör kullanarak kesme işlemi yapın . </li><li> Makaslamadan sonra, örnekleri 1.5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C&#39;de ve ~ 18.000 x g&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı yeni tüplere aktarın. </li><li> Adım 3&#39;e göre kesilme verimliliğini belirlemek için 50 μL toplayın ve sıvı azot içinde kesilmiş lisatı derhal dondurun. Lizatı tek kullanımlık alikotlar halinde -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Kesme Verimliliğinin Belirlenmesi <ol><li> 50 ul 50 ul elüsyon tamponu ekleyin ve #181 L; her bir kesilmiş lizatın l&#39;si ve gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li><li> 100 uL TE tampon ve 4 μL 10 mg / mL RNaz A (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir numuneye 2 mcL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve sallayarak 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her numuneyi, fenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 200 ul fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C ve ~ 16000 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, fenol, kloroform ve izoamil alkollü atıkları idare edinEv sahibi kurumun kurallarına göre. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: <ol><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüp oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakılmalıdır. </li><li> Elüsyon için, oda sıcaklığında 1 dakika inkübe 50 mcL H 2 O ekleyin, düzgün membran ıslak 1 s tüp ve 1 dakika için santrifüjleme ile DNA elute önce 1 dakika oda sıcaklığında inkübe 24 ° C ve ~ 17.900 x g. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak saflaştırılmış DNA&#39;yı bir florometre üzerinde ölçün. </li><li> % 1.8 agaroz jel üzerinde yaklaşık 500 ng saflaştırılmış DNA&#39;yı ve yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sistemi üzerinde yaklaşık 1 ng analiz edin. Not: beklenen sizE DNA parçaları 200 ila 500 bp arasındadır. </li></ol> 3. ve 4. gün 4. İmmunopresipitasyon <ol><li> 1 hacim kesilmiş lizat, 5 hacim seyreltme tamponu ile seyreltin. </li><li> Soğuk odada dönerken 30 μL / mL protein A agaroz boncuk ( Ek A&#39;ya göre hazırlanmıştır) ile 30 dakika süreyle önceden temizleyin. </li><li> ~ 750 x g&#39;de 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Girişin% 10&#39;unu toplayın ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> İstenen lizat miktarını yeni tüplere koyun (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın). Her bir tüpe istenen antikorları ekleyin (ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de döndürün. </li><li> 40 μL protein A boncuk ekleyin ve döndürürken 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Boncukları 1 mL düşük tuzlu tampon, yüksek tuzlu tampon, LiCl tampon ve TE tampon ile yıkayın (her yıkama için döndürürken 5 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin ve santrifüj edin4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika). Ayrıntılar için Tablo 3&#39;e bakın. </li><li> Elüsyon tampon 110 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe, her 2 dakikada vorteksleme. </li><li> 4 ° C&#39;de ve ~ 950 xg&#39;de 3 dakika boyunca santrifüjleyin ve yüzer kısım 100 uL tekrar yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. </li><li> 4.7-4.8 adımlarını 100 uL elüsyon tamponuyla tekrarlayın ve eluatları birleştirin. Örnekleri girmek için elüsyon tamponu 200 μL&#39;ye kadar ekleyin. </li><li> Bütün örnekleri gece boyunca 65 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin. </li></ol> 5. Gün 5. DNA Saflaştırması <ol><li> Her eluat için 200 uL TE tamponu ve 10 mg / mL RNaz A (8 μL, 0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin. Karıştırıp 37 ° C&#39;de 2 saat çalkalayarak inkübe edin. </li><li> Her bir eluat için 4 μL 20 mg / mL proteinaz K (0.2 μg / μL son konsantrasyon) ilave edin ve çalkalamayla 55 ° C&#39;de 2 saat inkübe edin. </li><li> Her bir örneği jöle haline getirinFenol / kloroform / izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun tüp; Üreticinin talimatlarına göre tutun. </li><li> 400 μL fenol / kloroform / izoamil alkol (25: 24: 1) ilave edin ve tüpleri sallayın. 24 ° C&#39;de ve ~ 16.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı yeni tüplere aktarın. Dikkat: Fenol, kloroform ve izoamil alkol inhale edildiğinde toksiktir ve koroziftir; Davlumbazın altında çalışın ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Ayrıca, ev sahibi kurumun kurallarına göre fenol, kloroform ve isoamil alkol atığını ele alınız. <ol><li> Tekrarla. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki değişikliklerle saflaştırma sütunları kullanarak DNA&#39;yı saflaştırın: </li><li> Zar iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra kalan etanolün buharlaşması için tüpleri oda sıcaklığında 2 dakika açık bırakın. </li><li> Elüsyon için, 50 μL H 2 O ekleyin, oda temperatuasında inkübe edin1 dakika boyunca tekrarlayın, zarları düzgün ıslatmak için tüpleri 1 s döndürün ve 1 dakika boyunca 24 ° C&#39;de ve ~ 17.900 x g&#39;de santrifüje tabi tutarak DNA&#39;yı elute etmeden önce oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin. </li></ol>

<ol><li>Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+landscape+and+transcription+factors+in+T+cell+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chromatin landscape and transcription factors in T cell programming.</a> Trends Immunol. 35 (5), 195-204 (2014).</li>
<li>Zhang, J. A., Mortazavi, A., Williams, B. A., Wold, B. J., Rothenberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transformations+of+genome-wide+epigenetic+marking+and+transcriptional+control+establish+T+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic transformations of genome-wide epigenetic marking and transcriptional control establish T cell identity.</a> Cell. 149 (2), 467-482 (2012).</li>
<li>Cauchy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+Ets1+to+both+nucleosome-occupied+and+-depleted+enhancer+regions+mediates+a+transcriptional+program+switch+during+early+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of Ets1 to both nucleosome-occupied and -depleted enhancer regions mediates a transcriptional program switch during early T-cell differentiation.</a> Nucl Acids Res. 44 (8), 3567-3585 (2016).</li>
<li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+platforms+and+GTF+recruitment+at+tissue-specific+enhancers+and+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation platforms and GTF recruitment at tissue-specific enhancers and promoters.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (8), 956-963 (2011).</li>
<li>Pekowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+tri-methylation+provides+an+epigenetic+signature+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers.</a> EMBO J. 30 (20), 4198-4210 (2011).</li>
<li>Vanhille, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+quantitative+assessment+of+enhancer+activity+in+mammals+by+CapStarr-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput and quantitative assessment of enhancer activity in mammals by CapStarr-seq.</a> Nat Commun. 6, 6905(2015).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Ernst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+analysis+of+chromatin+state+dynamics+in+nine+human+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types.</a> Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).</li>
<li>Ostuni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+enhancers+activated+by+stimulation+in+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Latent enhancers activated by stimulation in differentiated cells.</a> Cell. 152 (1-2), 157-171 (2013).</li>
<li>Giaimo, B. D., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+chromatin+regulation+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Dynamic chromatin regulation at Notch target genes.</a> Transcription. 8 (1), 61-66 (2017).</li>
<li>Liefke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+KDM5A+is+an+integral+part+of+the+core+Notch-RBP-J+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase KDM5A is an integral part of the core Notch-RBP-J repressor complex.</a> Genes Dev. 24 (6), 590-601 (2010).</li>
<li>Jung, C., Mittler, G., Oswald, F., Borggrefe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+Ddx5+and+the+noncoding+RNA+SRA+act+as+coactivators+in+the+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">RNA helicase Ddx5 and the noncoding RNA SRA act as coactivators in the Notch signaling pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (5), 1180-1189 (2013).</li>
<li>Oswald, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phospho-dependent+mechanism+involving+NCoR+and+KMT2D+controls+a+permissive+chromatin+state+at+Notch+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A phospho-dependent mechanism involving NCoR and KMT2D controls a permissive chromatin state at Notch target genes.</a> Nucl Acids Res. 44 (10), 4703-4720 (2016).</li>
<li>Arrigoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+chromatin+research%3A+a+simple+and+universal+method+for+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Standardizing chromatin research: a simple and universal method for ChIP-seq.</a> Nucl Acids Res. 44 (7), e67(2016).</li>
<li>Essen, D., Dullforce, P., Brocker, T., Gray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+involved+in+Th+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions involved in Th cell memory.</a> J Immunol. 165 (7), 3640-3646 (2000).</li>
<li>White, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+better+cell+lines+for+making+hybridomas+expressing+specific+T+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two better cell lines for making hybridomas expressing specific T cell receptors.</a> J Immunol. 143 (6), 1822-1825 (1989).</li>
<li>Ghisletti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+enhancers+controlling+the+inflammatory+gene+expression+program+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of enhancers controlling the inflammatory gene expression program in macrophages.</a> Immunity. 32 (3), 317-328 (2010).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
<li>Fenouil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+islands+and+GC+content+dictate+nucleosome+depletion+in+a+transcription-independent+manner+at+mammalian+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CpG islands and GC content dictate nucleosome depletion in a transcription-independent manner at mammalian promoters.</a> Genome Res. 22 (12), 2399-2408 (2012).</li>
<li>Hein, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+methylation+of+Notch1+controls+the+amplitude+and+duration+of+the+Notch1+response%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Site-specific methylation of Notch1 controls the amplitude and duration of the Notch1 response.</a> Sci Signal. 8 (369), ra30(2015).</li>
</ol>

Yazarların rekabette finansal çıkarları yoktur.

ChIP, proteinlerin veya bunların PTM&#39;lerinin spesifik genomik bölgede zenginleşip zenginleşmediğini araştırmak için geçerli bir tekniktir. ChIP test sonuçları biyolojik veya teknik nedenlerden dolayı genellikle yorum yapmakla zorlanır. Biyolojik nedenler çok katlıdır ve proteinlerin DNA&#39;ya zayıf veya dolaylı olarak bağlanmasını içerir. Sınırlı antikor özgüllüğü ve verimsiz hücre lizisi veya kromatin kesme gibi teknik sınırlamalar da vardır. Bir sorun giderme kılavuzu ( Çizelge 5 ), okuyucunun ChIP analizlerinde karşılaşılabilecek sorunları çözmesine yardımcı olabilir. Soğutma odaklı bir ultrasonator cihazından yararlanan bu protokol, olgunlaşmış bir fare T hücre çizgisinin kromatinini verimli bir şekilde kesmesine izin verir. Protokolün asıl kritik basamağı, her zaman her hücre tipi için optimize edilmiş olması gereken kromatin kesilmesi ile temsil edilir. Hücrelerin sayısını ve sonikasyon çevrimlerinin sayısını değiştirmek önerilir. Ayrıca, o<html> SDS liziz tamponu ile buz üzerinde hücrelerin lizizi sırasında oluşabilecek örneklerdeki SDS çökeltilerinin varlığı olumsuz etkilenir. Bu durumda, SDS çökeltilerinin varlığını azaltmak için numuneyi oda sıcaklığında birkaç dakika boyunca lüsizasyondan sonra inkübe etmek en iyisidir. 200 ile 500 bp arasında kesilmiş fragmanları elde etmek için protokolü optimize etmek ve immüno çökeltme işlemine başlamadan önce numunelerin kesilme kalitesini daima değerlendirmek önerilir. Ayrıca sabitleme zamanı, antikor ve / veya hücrelerin miktarı ve yıkama koşulları, her bir antikor için optimize edilmelidir. Bir ChIP prosedürünü başarılı bir hale getirirken bir diğer kritik adım, antikorun seçilmesidir, çünkü düşük özgünlük antikorları immüno çökelmenin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Daha önce, piyasada bulunan çeşitli antikorların özgüllüğünün değerlendirilmesine izin verilen birleştirilmiş bir kalite testi prosedürü<html> Ss = &quot;xref&quot;&gt; 19. Tarama hattı, dot blot, Western blot ve ChIP&#39;e dayanılarak ChIP 19 için uygun yüksek kaliteli reaktiflerin bir listesi sağladı. Daha yakın zamanlarda, ticari olarak temin edilebilen birkaç antikorun spesifitesi, antikor özgüllüğü üzerine bir veri tabanının oluşturulmasına izin veren, yüksek yoğunluklu histon peptid mikrodizi platformları kullanılarak değerlendirildi. Okuyucu ChIP deneyleri için kullanılabilecek en spesifik antikorları tanımlamak için bu yararlı aracı kullanabilir. Bu protokol, birincil T hücreleri için test edilmemiştir ve bu durumda okuyucu, birincil T hücreleri 3 , 4 ve 21 üzerinde ChIP&#39;yi başarılı bir şekilde gerçekleştiren yayınlanmış protokollere başvurmalıdır. Özellikle, bu protokol bir fare endojen hücre hattının yanı sıra bir fare progenitör T-hücresi hattı üzerinde ChIP&#39;i başarıyla yerine getirmek için kullanılmıştır. Ove_content &quot;&gt; Histon işaretlerinin analizi için her immüno çökelme için 5 x 106 hücre kullanılmalıdır.Bu protokol TF&#39;ler veya kofaktörler üzerinde ChIP gerçekleştirmek için bazı optimizasyonlarla birlikte de uygun olabilir, bu nedenle hücre sayısını artırmak en iyisidir Bu vakalarda immüno çökeltme için kullanılmıştır Her deney için gerekli hücre sayısına ulaşmak için, dilimlenmiş lizatın daha küçük kısımları seyreltme tamponu içerisinde kromatin seyreltmeden önce bir araya toplanabilir. Bu protokol doğrudan DNA&#39;ya bağlanmayan endojen proteinler üzerinde ChIP gerçekleştirmek üzere modifiye edilebilir. Bu durumda, protein-protein çapraz bağlayıcılarla ( örneğin dimetil adipimidat, DMA) ön fiksasyon gerekebilir (daha fazla bilgi için Ek B&#39;ye bakınız). Kofaktörlerde ChIP&#39;in başarılı bir performansı, daha önce bir biotin etiketi ile kaynaştırılmış aşırı ifade eden proteinler tarafından yapılmıştır. Bu durumda, protein streptavidin-konjuga ile saflaştırılmıştırTed manyetik boncuklar ve DMA ile ön fiksasyon yapıldı 22 .

Gelişme, farklılaşma ve homeostaz, kromatin yapısını modüle eden ve bu nedenle belirli bir genin bir hücre ve zamana özgü biçimde aktive edilip engellenmediğini belirleyen olayları bildiren belirli gen ekspresyon programlarına bağlıdır. T-hücresi gelişimi sırasında, birkaç ara evreden 1 geçerek çift negatif (DN) ila tek pozitif (SP) haldeki T hücresi öncüllerinin olgunlaşmasını doğru bir şekilde belirlemek için spesifik gen ekspresyon programları oluşturulmalıdır. Gen ekspresyon programının T hücresi gelişimi sırasında dinamik olarak nasıl düzenlendiği, önceki laboratuvarlarda 2 , 3 , 4 , 5 , 6 numaralı laboratuvarlar tarafından geniş çapta araştırılmıştır. Histonların post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler) ile,Histon varyantlarına sahip kanonik histonlar, nükleozom tahliye ve DNA metilasyonu, genlerin ON / OFF anahtarını düzenler. Çeşitli gruplar, proksimal ve distal düzenleyici bölgelerde 7 , 8 , 9 , 10 farklı kromatin durumlarıyla ilişkili işaretleri belirlemek için PTM&#39;lerin ve histon varyantlarının genom çapında dağılımını araştırdılar. Sinyalizasyon, spesifik arttırıcı elementlerde pozitif ve negatif kromatin değiştirici enzimlerin (ayrıca kromatin modifiye edici olarak da bilinir) değişimi yoluyla dinamik kromatin düzenlenişini düzenler. Bu kromatin değiştiriciler kromatin yapısını ve dolayısıyla transkripsiyonel çıktıyı örneğin dinamik histon metilasyonu ve asetilasyon ile düzenler. Notch sinyal yolunda 11 , 12 , 13 ,14. Dinamik histon PTM&#39;leri; Histon varyantları ile alışverişler; Ve histonların, transkripsiyon faktörlerinin ve kofaktörlerin dinamik dolaşımı, kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri ile araştırılabilir. Belirli DNA-protein komplekslerini saflaştırmak için oldukça spesifik antikorlar kullanılır ve saflaştırılmış DNA kantitatif PCR (qPCR) ile analiz edilir; Derin dizilim (ChIP-Seq); Veya günümüzde daha az sıklıkla, mikrodiziye hibridizasyon (ChIP-ChIP). ChIP tahlilleri, bazen hücrelerin lizisi, kromatin kesilmesi ve / veya antikorların düşük özgüllüğü ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle zorlayıcıdır. NEXSON 15&#39;te olduğu gibi, protokolü geliştirmek için çeşitli stratejiler benimsenmiştir. Soğutma suyu banyosu sonikatörlerinin kullanılması, araştırılan protein üzerindeki epitoplara zarar verebilecek numune ısıtmasından kaçınır, ancak numunelerin kesilmesi için gereken enerji suya dağılır.Enerjinin dağılmasını önleyen odaklanmış ultrasonication cihazlarının geliştirilmesi ile bir başka gelişme yapılmıştır. Bu nedenle, odaklanmış ultrasonatör cihazları, hücre lizizinde ve kromatin makaslamada iyileştirme yapmaya, operatöre bağlı varyasyonları ortadan kaldırmaya ve tekrarlanabilirliği önemli ölçüde arttırmaya olanak tanır. Bu çalışma , E2-10HA 16 , 17 olarak adlandırılan olgun bir fare T hücresi çizgisindeki histon proteinlerinin ChIP&#39;ini etkili bir şekilde gerçekleştirmek için bir protokolü ( Şekil 1&#39;deki şematik genel bilgi) açıklar. T-hücrelerinin çözülmesi genellikle zordur ve kromatinlerinin kesilmesi yetersizdir. Soğutma odaklı bir ultrasonatörü kullanan bu protokolde, hücre sayısı, liziz tamponu ve kesme ayarı E2-10HA fare T hücre dizisi için optimize edildi. Bu protokol, yüksek bir tekrarlanabilirlik ve makul bir zamanda ChIP gerçekleştirmesine olanak tanır. Aslında, requirKromatin kesmek ve makaslama kalitesini değerlendirmek için yaklaşık iki gün, immüno çökelmeyi gerçekleştirmek için üç gün, çapraz bağın tersini çevirin ve DNA&#39;yı arındırın.

<table><tbody><tr><td>Agilent Yüksek Hassasiyetli D5000 Reaktifleri</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5593</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Yüksek Hassasiyetli D5000 ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5592</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tapestation 4200</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S220 AFA Sistemi</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td></td></tr><tr><td>dimetil adipimidat (DMA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20660</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Pan-Biotech</td><td>1502-P121301</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un modifiye edilmiş Dulbecco'nun ortamı (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Minimum esansiyel ortam esansiyel olmayan amino asitler (MEM NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>nProtein A Sefaroz 4 Hızlı Akış</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5280-02</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pepton primaton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4963-100G</td><td></td></tr><tr><td>Faz Kilit Jeli Ağır 2 &nbsp; mL</td><td>5 Prime</td><td>2302830</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1)</td><td>Roth</td><td>A156.2</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K Çözeltisi (20 mg/mL), RNA sınıfı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit tahlil tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>RNase A, DNaz ve proteaz içermez (10&nbsp; mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Tüp AFA Elyaf & Kap</td><td>Covaris</td><td>520081</td><td></td></tr></tbody></table>

fare t-hücresi hatlarında kromatin İmmünopresipitasyonu (chip)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Sinyal yolakları, histon kuyruklarının post translasyonel modifikasyonları (PTM&#39;ler), histon varyantları ile kanonik histonların değişimi ve nükleozom tahliye gibi farklı seviyelerde kromatin yapısının modülasyonu yoluyla gen ekspresyon programlarını düzenler. Bu düzenleme, arttırıcılar olarak tanımlanan düzenleyici elemanlarda kromatin değiştirici enzimleri işe yarayan sinyal duyarlı transkripsiyon faktörlerinin (TF&#39;ler) bağlanmasını gerektirir. Sinyal olay kaskadlarının arttırıcı aktiviteyi nasıl düzenlediğini anlamak TF&#39;lerin, kromatin değiştirici enzimlerin bağlanmasının ve spesifik histon işaretlerinin ve histon varyantlarının dolaşımının kapsamlı bir analizini gerektirir. Kromatin immüno-çökeltme (ChIP) tahlilleri, spesifik protein / DNA komplekslerini immüno-çökeltmek için yüksek spesifik antikorları kullanır. Saflaştırılmış DNA&#39;nın sonraki analizi, antikor tarafından tanınan protein tarafından işgal edilen bölgenin tanımlanmasına izin verir. Bu çalışma verimli bir şekilde peOlgun fare T hücre dizisinde histon proteinlerinin ChIP&#39;ini oluşturun. Sunulan protokol, ChIP tahlillerinin makul bir zaman aralığında ve yüksek tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirilmesini sağlar.

Olgun fare T hücreleri, lizin 4&#39;ün histon 3&#39;te (H3K4me1) histon marka mono-metilasyonunun zenginleştirilmesini, histon 3&#39;ün (H3K4me3) lisin 4&#39;ün tri-metilasyonunu ve lizin 27&#39;nin asetillenmesini incelemek için ChIP analizine tabi tutuldu. Histone 3 (H3K27ac) yanı panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarılan nükleozom doluluğu. Kesme kalitesi,% 1.8 agaroz jeli ( Şekil 2A ) ve bir elektroforez sistemi ( Şekil 2B ) üzerinde analizle değerlendirildi. H3K4me1 ve H3K4me3, sırasıyla arttırıcı bölgeleri ve yükselticileri tanımlamak için kullanılır ( Şekil 3A ). Nitekim H3K4me3 belirgin olup yalnızca promotörler 5 , 8 , 14&#39;te zenginleştirilmiş değildir. Aktif arttırıcıların bir özelliği, H3K4me1 ve H3K27ac için oldukça zenginleştirilmiş olması ve H3K4me3 için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olmasıdır (&lt;Inaktif arttırıcılar, düşük H3K4me3 ve H3K27ac seviyeleri, ancak yüksek H3K4me1 seviyeleri gösterirler ( Şekil 3A , alt panel). Şekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh ) geni, aktif gen promotörlerinin ( Gapdh promotörünün ) analizini temsil etmektedir . Gerçekte, yüksek seviyelerde H3K4me3 ve H3K27ac ve düşük H3K4me1 seviyeleri gösterir. Şekil 3B&#39;de Deltex1 ( Dtxl ), H3K4me1 için zenginleştirilmiş ve H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş olduğu için, inaktif arttırıcıları ( Dtx1 arttırıcı ) temsil etmektedir. Gen çölü , kodlayıcı genlerden yoksun bir bölgeyi temsil eder ve genellikle aktif kromatin işaretleri için negatif bir kontrol olarak dava edilir. H3K4me1, iyi kabul görmüş arttırıcı işaret 4 , 5 , </sup&gt; 7 , 14 , 18 , Gen çölde zenginleştirilmiş değil, bu bölgenin güçlendirici bulunmadığını öne sürüyor. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig1.jpg" /> Şekil 1: Sunulan ChIP protokolünün şematik görünümü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig2.jpg" /> Şekil 2: olgun fare T hücre hattının kesme kalitesi kontrolü. ( A ) Olgun fare T hücre çizgisi E2-10HA&#39;nın iki farklı bölüntüsü kesildi ve yaklaşık% 500 saflaştırılmış DNA,% 1.8 agaroz jeli üzerinde analiz edildi ve kesilip alınmadığı değerlendirildiIng kalitesi. ( B ) numune 2&#39;den 1 ng saflaştırılmış DNA, kesme kalitesini değerlendirmek için elektroforez ile analiz edildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55907/55907fig3.jpg" /> Şekil 3: arttırıcıları ve yükselticileri karakterize eden kromatin işaretleri. ( A ) Aktif arttırıcılar (üst panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve yüksek H3K27ac ile karakterize edilirken, inaktif arttırıcılar (alt panel) yüksek H3K4me1, düşük H3K4me3 ve düşük H3K27ac sunar. ( B ) Şekil 2A&#39;da sunulan numuneler bir araya getirildi ve panH3 ChIP tarafından ortaya çıkarıldığı üzere, histon markları H3K4me1, H3K4me3 ve H3K27ac ve histon doluluğu için ChIP analizi için kullanıldı. Bu analiz,E destekçisi Glyceraldehyde 3-fosfat dehidrogenaz ( Gapdh promotörü ), H3K4me3 ve H3K27ac için zenginleştirilmiş ve H3K4me1 için az zenginleştirilmiş. Öte yandan, aktif olmayan gen Deltex1&#39;in ( Dtx1 arttırıcı ) zenginleştiricisi, H3K4me1 için zenginleştirilmiş ancak H3K4me3 ve H3K27ac için zayıf şekilde zenginleştirilmiş. Nükleozomun doluluk oranını araştırmak için bir panH3 antikoru kullanan ChIP kullanıldı. Gen çölü negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Bir temsilci deney gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55907/55907fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Arabellek adı </td><td> reaktif </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td rowspan="5"> Seyreltme tamponu </td><td> Sodyum dodekIl sülfat (SDS) </td><td> % 0.01 (ağ / hac) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1.1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1.2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 16.7 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 167 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> DMA çözümü </td><td> Dimetil adipimidat (DMA) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="3"> Elüsyon tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Yüksek tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> EthylenediamiNetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td rowspan="6"> IMDM aracı </td><td> Iscove&#39;un modifiye Dulbecco&#39;s medium (IMDM) </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu (FBS) </td><td> % 2 (h / h) </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Pepton primatonu </td><td> 0.3 mg / mL </td></tr><tr><td> Insan insülini çözeltisi </td><td> 4.8 mg / mL </td></tr><tr><td> Minimum esansiyel orta zorunlu olmayan amino asitler (MEM NEAA) </td><td> 1x </td></tr><tr><td rowspan="4"> LiCl tuz tamponu </td><td> Lityum klorür (LiCI) </td><td> 0,25 M </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Düşük tuz tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td rowspan="5"> Protein A Sepharose boncuk yıkama tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td> Sodyum klorür (NaCI) </td><td> 500 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 0.1 (a / h) </td></tr><tr><td> IGEPAL-CA630 </td><td> % 1 (h / h) </td></tr><tr><td rowspan="3"> SDS Lysis tamponu </td><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> % 1 (a / h) </td></tr><tr><td> EthylenediAminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Tris-HC1 pH 8.1 </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> TE tamponu </td><td> Tris-HC1 pH 8.0 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 </td><td> 1 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve ortamın listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> AÇIK </td><td> KAPALI </td></tr><tr><td> Zirve gücü </td><td> 150,0 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Görev faktörü </td><td> 15.0 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> Döngüleri / patlama </td><td> 500 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Devir sayısı </td><td colspan="2"> 28 </td></tr></tbody></table>Tablo 2: Bu protokolde kullanılan kesme ayarları. Bu koşullar olgun bir fare T-hücresi hattı için optimize edilmiştir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antikor </td><td> satıcı </td><td> Antikor miktarı / immüno çökeltme </td><td> Hücrelerin miktarı / immüno çökeltme </td><td> Yıkama koşulları </td></tr><tr><td> H3 </td><td> Abcam (ab1791) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me1 </td><td> Abcam (ab8895) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K4me3 </td><td> Diagenode (pAb-003-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Bir kez düşük tuz tamponunda, iki kez Yüksek tuz tamponunda, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponunda </td></tr><tr><td> H3K27ac </td><td> Diagenode (pAb-174-050) </td><td> 2.5 mg </td><td> 5 x 10 6 </td><td> Düşük tuz tamponunda Oce, iki kez Yüksek tuz tamponu, iki kez LiCl tuz tamponu ve üç kez TE tamponu </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Diagenode (C15410206) </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td><td> Değişken* </td></tr><tr><td colspan="5"> * IgG kontrolü durumunda hem antikor hem de hücrelerin miktarı, yıkama adımları, diğer immüno çökeltilerin koşullarını yansıtmalıdır. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Bu çalışmada kullanılan antikorlar ve yıkama koşulları. <table border="1" fo:keEp-together.within-sayfa = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-sayfa = &quot;her zaman&quot;&gt; <tbody><tr><td> Gen </td><td> Ileri astar </td><td> Ters astar </td><td> sonda </td></tr><tr><td> Gapdh yönlendiricisi (0 kb) </td><td> 5&#39;-GGG TTC CTA TAA ATA CGG ACT GC-3 &#39; </td><td> 5&#39;-CTG GCA CTG CAC AAG AAG A-3 &#39; </td><td> 68 </td></tr><tr><td> Dtx1 arttırıcı (+26 kb) </td><td> 5&#39;-CTC TGG GTT GTA GGG GAC AG-3 &#39; </td><td> 5&#39;-GCA TGG GAA CTG TGT TAC AGA A-3 &#39; </td><td> 27 </td></tr><tr><td> Gen çölü </td><td> 5&#39;-CAA TGC ATG GGT CCA GAT TT-3 &#39; </td><td> 5&#39;-ATT GGC ACG GAA GTA GTG CT-3 &#39; </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Bu çalışmada qPCR için kullanılan primerler ve problar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within sayfalık = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> Sorun </td><td> Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin makaslanmış ve parçacıklar çok büyük. </td><td> Çok fazla hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücrelerin sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Makaslama çok düşüktür. </td><td> Kesme çevrimi sayısını artırın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe gücü, çalışma faktörü ve / veya devir / patlamayı arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Kromatin kesilmiş ve fragmanlar çok küçük. </td><td> Çok az hücre kullanılmıştır. </td><td> Hücre sayısını artırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Kesme çok yüksek. </td><td> Kesme çevrimi sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Kesme tepe enerjisini, görev faktörünü ve / veya devir / patlamayı azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="11"> Ben üzerinde çok düşük kurtarmaGG kontrolü ve / veya negatif kontrol (yüksek arka plan). </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok yüksek. </td><td> Antikor miktarını azaltın. </td></tr><tr><td> Antikorun özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları çok katıdır. </td><td> Yıkama sayısını azaltın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yıkama koşulları yeterince sıkı değildir. </td><td> Yıkama sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Yıkama tamponlarının sıkılığını arttırın. </td></tr><tr><td> QPCR&#39;de çok fazla DNA pipetle alındı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını azaltın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Girdi örneğinin qPCR reaksiyonunda hiçbir ürün veya ürün çok düşüktür. </td><td> QPCR&#39;de yeterli DNA pipete konmadı. </td><td> QPCR&#39;de pipetle alınan DNA miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="2"> QPCR koşulları optimal değildir. </td><td> QPCR koşullarını optimize edin. </td></tr><tr><td> Çevrim sayısını arttırın. </td></tr><tr><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Pozitif kontrol ve / veya panH3 Çipinde sinyal yok. </td><td> Deney için yeterli kromatin kullanıldı. </td><td> Kromatin miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> Antikor miktarı çok düşüktür. </td><td> Antikor miktarını arttırın. </td></tr><tr><td> AntiVücut özgüllüğü düşüktür. </td><td> Antikoru değiştir. </td></tr><tr><td> Elüsyon uygun değildir. </td><td> Boncukları çözelti içinde tutmak için numuneleri sık sık girdapladığınızdan emin olun. </td></tr></tbody></table> Tablo 5: Sorun Giderme.

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Bu protokolün genel amacı, spesifik genomik bölgelerdeki histon işaretlerinin dağılımını incelemek için fare T-hücre hatlarında kromatin immünopresipitasyonunu, makul bir sürede ve yüksek tekrarlanabilirlikle verimli bir şekilde gerçekleştirmektir. Bu yöntem, kromatin yapısının T-hücresi bölünmesi veya aktivasyonu sırasında nasıl düzenlendiği gibi, özellikle T-hücrelerine odaklanan kromatin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kromatin fragmentasyonunun verimli ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir olmasıdır.Fenol-kloroform izoamil alkol basamakları zorlayıcı olabildiğinden ve kromatin parçalama koşullarını belirlemek güç olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Prosedürü, laboratuvarımızda doktora öğrencisi olan Francesca Ferrante gösterecektir. Birinci günde, fare T-hücrelerini altı kuyucuklu plakadan 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Ardından hücreleri 24 °C'de yaklaşık 271 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Hücre peletini 30 mL IMDM hücre kültür besiyerinde yeniden süspanse ettikten sonra, bir Neubauer kamarası kullanarak hücreleri sayın. 20 milyon hücrelik alikotları yeni 50 mL'lik tüplere toplayın. Daha sonra, hücre kültür besiyerine doğrudan %1 son konsantrasyonda formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında on dakika boyunca inkübe edin.Ardından, 1 M glisin (pH 7,5) çözeltisinden toplam hacmin 1/8'i kadar ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Hücreleri 24 °C'de ve yaklaşık 271 ×g'de beş dakika santrifüj ederek çöktürün. Sonra hücre peletini 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspandirip santrifüj işlemini tekrarlayarak hücreleri yıkayın. Hücreleri 1 mL PBS ile tekrar yıkayın.Santrifüjlemeden önce resüspande edilen hücrelerin 1,5 mililitrelik tüplere aktarılması. Kromatinin parçalanması; hücre miktarına, parçalama tüplerine, cihaza ve lizis tamponuna yanı sıra parçalama parametrelerine bağlı olduğu için en kritik adımdır. Yıkama işleminin ardından, hücre peletini bir mililitre SGS lizis tamponunda resüspande edin ve buz üzerinde inkübe edin.10 dakika sonra, her örneği bir sonikasyon tüpüne aktarın. Ardından, metin protokolünde belirtilen ayarlara uygun olarak odaklanmış bir ultrasonikatör kullanarak parçalama (shearing) işlemini gerçekleştirin. Parçalamadan sonra, örnekleri 1,5 mililitre tüplere aktarın.4 °C'de ve yaklaşık 18.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı yeni tüplere aktarın. Kesme verimliliğinin belirlenmesi için 50 µL toplayın ve kesilmiş lizatı sıvı azot içerisinde hızlıca dondurun. Lizatı, tek kullanımlık alikotlar halinde -80 °C'de saklayın.Kesme verimliliğini belirlemek için, öncelikle her bir kesilmiş lizata 50 µL elüsyon tamponu ekleyin. Karışımları 65 °C'de, sallayarak gece boyunca inkübe edin. İkinci günde, örneklere 100 µL TE tamponu ve 4 µL 10 mg/mL Rnase A ekleyin.Numuneleri karıştırın ve 37 °C'de, çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, her numuneye 20 mg/mL proteinaz K'den iki µL ekleyin ve 55 °C'de, çalkalayarak iki saat daha inkübe edin. Sonrasında, her numuneyi fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonuna uygun bir jel tüpe aktarın.Tüpleri üretici talimatlarına göre kullanın. 200 µL fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve tüpleri çalkalayın. Santrifüj işleminin ardından, üst fazı yeni tüplere aktarın.Bu işlemi bir kez tekrarlayın. Üretici talimatlarına uygun olarak, membranı iki kez yıkama işlemi hariç, DNA'yı saflaştırma kolonları kullanarak saflaştırın. Son yıkamadan sonra, kalıntı etanolün uçması için tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca açık bırakın.Elüsyon için kolona 50 µL su ekleyin ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Ardından, membranın uygun şekilde ıslanması için tüpü bir saniye boyunca santrifüjleyin. DNA'yı santrifüjle elüye etmeden önce membranı oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin.Saflaştırılmış DNA'yı, üretici talimatlarına uygun olarak yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak florometrede miktar belirleyin. Son olarak, saflaştırılmış DNA'nın yaklaşık 500 nanogramını %1,8'lik agaroz jelde ve yaklaşık bir nanogramını yüksek hassasiyetli bir kit kullanarak bir elektroforez sisteminde analiz edin.Üçüncü günde, bir birim parçalanmış lizatı beş birim seyreltme tamponu ile seyreltin. Seyreltilmiş lizatı, soğuk odada rotasyon altında 30 dakika boyunca mililitre başına 30 µL Protein A agaroz boncukları ile ön temizlemeden geçirin. Numuneleri 4 °C'de, yaklaşık 750 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Temizlenmiş lizatın %10'unu girdi numuneleri olarak toplayın ve 4 °C'de saklayın.Ardından, temizlenmiş lizattan istenen miktarda yeni tüplere paylaştırın. Daha sonra, her tüpe seçilen antikorları ekleyin ve dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca döndürün. Dördüncü günde, 40 microliter Protein A boncuğu ekleyin.Karışımı, döndürerek 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Boncukları, döndürerek 4 °C'de beş dakika inkübe ederek 1 mL düşük tuzlu tamponla yıkayın. Ardından 4 °C'de ve yaklaşık 950 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Yıkama işlemini yüksek tuzlu tampon, lityum klorür tamponu ve TE tamponu ile tekrarlayın.Ardından numunelere 110 µL elüsyon tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin ve her iki dakikada bir vorteksleyin. Tekrar santrifüjledikten sonra, 100 µL süpernatanı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.Elüsyonu 100 µL elüsyon tamponu ile tekrarlayın ve elüatları birleştirin. Bu sırada, önceden toplanan girdi örneklerine 200 µL nihai hacme ulaşacak şekilde elüsyon tamponu ekleyin. Tüm örnekleri çalkalamalı olarak 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.Beşinci günde, her bir elüata 200 µL TE tamponu ve 8 µL 10 mg/mL Rnase A ekleyin. Örnekleri, 37 °C'de çalkalayarak iki saat inkübe etmeden önce karıştırın. Ardından, her bir elüata 4 µL 20 mg/mL proteinaz K ekleyerek 55 °C'de çalkalayarak iki saat inkübe edin. Sonrasında, her bir örneği fenol kloroform izoamil alkol ekstraksiyonu için uygun bir jel tüpüne aktarın.400 µL fenol kloroform izoamil alkol ekleyin ve tüpleri çalkalayın. Tüpleri santrifüj ettikten sonra, üst fazı yeni tüplere aktarın ve bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Son olarak, DNA'yı daha önce olduğu gibi saflaştırma kolonlarını kullanarak saflaştırın.Fare T-hücre hatlarının şerleme işlemine ait bu temsili sonuç, kromatinin etkili bir şekilde fragmente edildiğini göstermektedir. Burada, fare T-hücre hatlarında gerçekleştirilen temsili bir kromatin immünopresipitasyon deneyi gösterilmektedir. Temel metabolik gen olan gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenazın promotörü, histon üç üzerindeki lizin dördün trimetilasyonu açısından yüksek düzeyde zenginleşmiştir.Ve histon 3'teki lizin 27'nin asetillenmesi için geçerlidir. Ancak histon 3'teki lizin 4'ün monometilasyonu için geçerli değildir. Aksine, inaktif deltex-1 geninin enhancer bölgesi, histon 3'teki lizin 4'ün monometilasyonu açısından oldukça zengindir.Ancak histon üçte lizin dört trimetilasyonu ve histon üçte lizin 27 asetilasyonu için zayıf zenginleştirilmiştir. Bu prosedürü uygularken, örnekleri parçalamadan önce SDS çökeleklerini çözmeyi hatırlamak önemlidir.Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, T-hücrelerinde gen düzenlemesini çalışırken ortaya çıktı. T-hücrelerini seçtik çünkü tıbbi uygulamalarla oldukça ilgililer ve yüksek ökaryotlarda gen ekspresyonunu incelemek için en iyi tanımlanmış model sistemlerden birini temsil ediyorlar. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, kromatin biyolojisi alanındaki araştırmacıların memeli sistemlerde kromatin düzenlemesini keşfetmelerine ön ayak oldu.Bu tekniğin etkileri, T hücresi gen ekspresyon programlarının kurulmasının ve düzenlenmesinin ayrıntılı incelenmesine olanak tanıdığı için T hücresi ilişkili hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Formaldehit, fenol kloroform ve izoamil alkol ile çalışmanın son derece ciddi olduğunu ve bu prosedür uygulanırken çeker ocak altında çalışmak ve uygun koruyucu ekipman kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Bu yöntem fare T hücresi kromatin düzenlemesi hakkında bilgiler sağlayabilse de, endotelyal ve akciğer hücre hatları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

chromatin-immunoprecipitation-chip-in-mouse-t-cell-lines

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Kromatin immunoprecipitation ve ultra-yüksek verimli sıralama (ChIP-seq) kombinasyonu belirli bir doku ya da hücre hattı protein-DNA etkileşimleri belirlemek ve eşleyebilirsiniz. Boş bir örnek olarak transkripsiyon faktörü TCF7L2 ile deneyim kullanıyorsanız sonraki sıralama için yüksek kaliteli ChIP şablonu oluşturmak için nasıl.

Yüksek verim Sıralama için Yüksek Kalite Kromatin Immunoprecipitation DNA Şablon üretimi (ChIP-seq)

Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Biz tandem kromatin için adım adım bir protokol tarif immunoprecipitation sıralama (tChIP-Seq) hücre türüne özgü genom çapında histon değişiklik çözümleme sağlar.

TChIP-Seq: Hücre türüne özgü Epigenome profil oluşturma

Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Öğrenin, fare T-hücre hatlarında kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) protokolünü. Bu yöntem, histon işaretlerinin dağılımını inceleyerek kromatin biyolojisi ve immünoloji alanlarında önemli bilgiler sağlar.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Daha fazla video keşfet