הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא תרבית משותפת של ספרואידים סטרומיים תלת מימדיים של גידול מתאי סרטן הלבלב ופיברובלסטים להערכה מטבולית שלהם, באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות לגבי ההשפעות של מיקו הגידול על חילוף החומרים של התאים ועל הרגישות לתרופות. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם שהיא מהירה, קלה יחסית וניתנת לשחזור מאוד, ושניתן להתאים אותה בקלות למקרים אחרים של יישור תאים.

מדגימים את ההליך יהיו, פאוואן נואל ורובן מוניוז. באמצעות טכניקה סטנדרטית של תרבית רקמה אספטית, תרבית את התאים הסרטניים והפיברובלסטים המעניינים בצלוחיות T75 במדיום הגידול המתאים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70% עד 80%, יש לשטוף את התרביות פעם אחת, בחמישה מיליליטר PBS ולנתק את התאים ממשטחי הבקבוק, עם שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA לבקבוק למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר אישור הניתוק במיקרוסקופ, השבת את הטריפסין עם שמונה מיליליטר של מצע גידול לכל בקבוק, ופיפטה את התאים כמה פעמים, כדי ליצור תרחיפי תאים בודדים לספירה. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בריכוזי תאים 1 x 10 עד שישי למיליליטר במדיום גידול טרי. כדי למגנט את התאים, הוסף 10 מיקרוליטר של ננו-מעבורת במדיום הגידול, pe 100 מיקרוליטר תאים וערבב את התמיסות בעדינות.

הפוך בעדינות את הצינורות כמה פעמים והעביר את תערובות הננו-מעבורת של התאים לבארות בודדות של צלחת 24 בארות. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים בניעור עדין, כדי להקל על קשירת הננו-מעבורת לפני התא. בתום הדגירה המחייבת, ערבבו בעדינות כל תרחיף תא ממוגנט עם פיפטינג והתאימו את הריכוז ל -1.5 x 10 לתאי הסרטן הממוגנטים הרביעיים או פיברובלסטים לכל 150 מיקרוליטר מדיום.

מערבבים את הפיברובלסטים ותאי הסרטן ביחס של שניים לאחד, בסך הכל 150 מיקרוליטר של תאים זרועים לבאר. הנח את צלחת דוחה התאים 96 באר על גבי הכונן הספרואיד המגנטי של 96 בארות עם מגנטים דקים יותר וזרע 150 מיקרוליטר של תערובת תאים לכל באר. כאשר כל התאים היו מצופים, דגרו את הצלחת למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, כאשר הכונן הספרואיד המגנטי עדיין מחובר.

למחרת בבוקר, הסר את הכונן המגנטי והחזיר את התאים לאינקובטור עד שבעה ימים נוספים. יום לפני הבדיקה המטבולית, הרטיבו את מחסנית הבדיקה עם 200 מיקרוליטר של קליבר בדיקה לבאר בצלחת השירות המסופקת ודגרו את לוחית השירות למשך הלילה, באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ללא CO2. למחרת בבוקר, התבוננו בכדורים בלוחית הגידול תחת מיקרוסקופ אור, כדי לבדוק את המורפולוגיה והאחידות הכללית שלהם.

העבירו את לוחית הגידול לכונן אחיזה מגנטי ושאבו בזהירות כ-120 מיקרוליטר של מצע גידול לבאר. שוטפים בעדינות את הספרואידים עם 120 מיקרוליטר של מדיום בדיקה מחומם שלוש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, בדוק שוב את הספרואידים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים לא נשטפו והוסף 180 מיקרוליטר של מדיום בדיקה מחומם לכל באר.

השתמש בקצה קדח רחב כדי לשאוב בזהירות ספרואיד יחיד שטוף מראש מלוח הגידול דוחה התאים ולהעביר בעדינות את הספרואיד ישירות למרכז באר אחת של לוחית בדיקת ספרואיד, מה שמאפשר לספרואיד ליפול לתוך תא המיקרו המרכזי של הבאר על ידי כוח הכבידה. לאחר שכל הספרואידים הועברו, הנח את לוחית הבדיקה באינקובטור האוויר הלח שאינו CO2 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. במהלך הדגירה, כוון את מחסנית החיישן כך ששורות A עד H יהיו בצד שמאל והנח מוביל טעינה על גבי המחסנית, כך שהאות המתאימה ליציאה שיש לטעון, תהיה בפינה השמאלית העליונה.

אם הצלחת נטענה באופן שווה, פתח את תוכנת הניתוח ולחץ על תבניות. לחץ פעמיים על תבנית ריקה ולחץ על צור קבוצות. תחת לשונית מפת הצלחת, הקצה קבוצות ללוחית הבדיקה, המתאימות לתכנון הניסיוני ובחר את ארבע הבארות הפינתיות כבארות הרקע.

תחת לשונית פרוטוקול המכשיר, בדוק כיול, שיווי משקל ומחזור מדידה בסיסי. לחץ על הזרקות והגדר את התרכובת עבור כל יציאה. שנה את מחזורי המדידה לשישה, סקור את הפרוטוקול ואת סיכום הקבוצה ולאחר מכן שמור את תבנית עיצוב הבדיקה.

בהתבסס על תכנון הבדיקה כמדריך, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא כל מגיב ישירות לתוך יציאות ההזרקה, תוך החזקת מובילי הטעינה במקומם בקצות האצבעות. לאחר טעינת כל הריאגנטים, הסר את מוביל הטעינה והחזק את המחסנית בגובה העיניים כדי לבדוק חזותית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה. העבר את המחסנית בלוחית השירות למנתח השטף החוץ-תאי והתחל את כיול הבדיקה המוקדמת.

לאחר הכיול, החלף את לוחית השירות בלוחית הבדיקה המחוממת מראש המכילה את הספרואידים התלת-ממדיים והתחל בבדיקה. בסיום הבדיקה, ייצא את הנתונים לתוכנת ניתוח הנתונים המתאימה. בניסוי טיפוסי, קוטר הספרואידים גדל מכ-400 מיקרומטר ביום השני לכמעט 600 מיקרומטר ביום השביעי, לאחר ההדפסה, ללא עלייה משמעותית לאחר היום השביעי.

כל שלושת סוגי התרביות הספרואידיות מציגים תגובה פונקציונלית ביולוגית לבדיקת הלחץ הגליקוליזי בתגובה להזרקה של ריכוז רווי של גלוקוז כפי שמעידה עלייה בשיעורי הטענה החוץ-תאית שלהם. באופן כללי, אות שיעור טענה חוץ-תאי גבוה יותר מספרואידים שמקורם בתאי גידול, בהשוואה לאות מספרואידים קטנים יחסית שמקורם בפיברובלסטים PS1, אולי מיוחס לנטייה המטבולית המובנית לגליקוליזה של תאי הסרטן. במבחן מאמץ מיטוכונדריה מייצג זה של ספרואידים פיברובלסטים של גידול, נצפתה ירידה בנשימת המיטוכונדריה בתגובה למעכב של ATP סינתאז, בקורלציה לחלק הנשימה של המיטוכונדריה המשמש לייצור ATP תאי.

זריקה שנייה עם חומר ניתוק, עוררה את צריכת החמצן המקסימלית של הספרואידים עם העלייה המקבילה בנשימת המיטוכונדריה. הזרקה שלישית של מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים 1 ו-3, חסמה את נשימת המיטוכונדריה שנצפתה בירידה חדה בקצב צריכת החמצן. ניתן להשתמש בפרמטרים אלה ובקצב הנשימה הבסיסי, כדי לחשב את דליפת הפרוטונים ויכולות הנשימה העודפות של הספרואידים, ולספק ניתוח מטבולי רב-פרמטרי של הספרואידים הממוגנטים.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות, אם היא מתוכננת היטב. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להרטיב את הגשושית באינקובטור של 37 מעלות ארבע עד 16 שעות לפני ביצוע הבדיקה המטבולית. לאחר הליך תרבית הספרואידים, ניתן לבצע בדיקות אחרות כמו ניסויי תגובת מינון כדי לענות על שאלות נוספות לגבי יעילות התרופה, רעילות, חודרים ורגישות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סרטן הלבלב לחקור את אינטראקציות סטרומה של הגידול בתוך המיקרו-סביבה של הגידול במודל תלת מימדי המחקה את הביולוגיה של הגידול in-vivo ומאפייניו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית ספרואידים תלת מימדיים, החל מגידול לבלב מתורבת ותאי פיברובלסטים ועד לניתוח במורד הזרם של תפקודים מטבוליים תאיים.