קונאפוקלית הדמיה של Neuropeptide Y-pHluorin: טכניקה להמחיש אינסולין אקסוציטוזה גרגר ב איונים מאתר ואנושי ללא פגע

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לדמיין אקסוציטוזיס של גרגיר אינסולין בזמן אמת באיי לבלב שלמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו תענה על שאלות מפתח בתחום הסוכרת. לדוגמה, מה מווסת אקסוציטוזיס של אינסולין?

זה קריטי מכיוון שאיחוי גרגירים הוא האירוע החשוב ביותר בחייו של תא טוב יותר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להשתמש באיים שלמים, אנו יכולים לראות אירועי היתוך בתאים בסביבתם הטבעית. מדינה מחקמוטובה, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו תדגים את הטכניקה.

ההתחלה, עם הגעתם של איי הלבלב, מעבירה אותם לצינורות בז של 50 מיליליטר ומצנטריפוגה את מתלה האיים ב-1,000 סיבובים לדקה למשך חמש דקות. האיים יאספו בתחתית הצינור, יעבירו את האיים בשני מיליליטר של תרבית CMRL בינונית ל-35 מילימטר שטופלו בתרבית רקמות וידגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפני הזיהום הנגיפי. לאחר בידודם, השעו מחדש בערך שווי ערך לאי הלבלב של העכבר בשני מיליליטר של מדיום תרבית CMRL והעבירו אותם לצלחות פטרי של 35 מילימטר שאינן תרבית רקמות.

דגרו על הרקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפני הדבקה ויראלית. כדי לבצע זיהום ויראלי, הוסף חמישה עד 10 מיקרוליטרים של נגיף מלאי לכל צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה איים אנושיים או עכברים בשני מיליליטר של מדיום תרבית CMRL. לאחר תרבית האיים במשך 24 שעות, שאפו את המדיום והחליפו אותו בשני מיליליטר של מדיום תרבית CMRL ללא נגיף.

מגדלים את האיים במשך ארבעה עד שישה ימים, ומחליפים את המדיום כל שלושה ימים. הכן תמיסה חוץ-תאית על ידי שילוב הריאגנטים המפורטים כאן ולאחר מכן מסנן לעקר את המאגר. הפוך את הגלוקוז הבסיסי לבינוני לריכוז גלוקוז סופי של שלושה מילי-מולריות, על ידי הוספת 75 מיקרוליטר של שני מלאי גלוקוז מולארי ל-50 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית.

לאחר מכן כדי להכין מדיום היפרגליקמי לריכוז גלוקוז סופי של 16 מילי-מולרי, הוסף 400 מיקרוליטר של שני מלאי גלוקוז מולארי ל-50 מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית. יש לדלל כל גירוי נוסף ותמיסה חוץ-תאית המכילה שלושה מילי-מולארי גלוקוז. לפני תחילת הניסוי, יש לטפל מראש בהחלקות כיסוי עם 30 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר תמיסת פולי-די-ליזין ולדגור למשך שעה.

לאחר מכן השתמש במים כדי לשטוף היטב את החלקות הכיסוי. לפחות שעה לפני הניסוי, העבירו קבוצת איים לצלחת פטרי של 35 מילימטר המכילה תמיסה חוץ-תאית עם גלוקוז של שלושה מילימולרים. שמור על האיים הנותרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

30 דקות לפני תחילת הניסוי, חבר את פתק הכיסוי לתא ההדמיה באמצעות גריז סיליקון כדי לאטום אותו. לאחר מכן קבע את תא ההדמיה לפלטפורמת ההדמיה. לאחר מכן, בעזרת פיפטה, העבירו 20 עד 30 איים לאזור המטופל בפולי-די-ליזין של הכיסוי ותנו לאיים להיצמד לפני השטח למשך 20 דקות.

שלב זה הוא קריטי להצלחת הניסוי ואנו אוספים כ-20 עד 30 איים בפחות מ-10 מיקרוליטר של חיץ ומחכים 20 דקות. חשוב לא לתת לכיסוי להחליק להתייבש לחלוטין, כדי למנוע נזק לאי. בזמן שהאיים נצמדים להחלקת הכיסוי, הכינו את מערכת הזלוף באמצעות מים כדי לשטוף אותה היטב.

לאחר מכן הוסף כל פתרון לערוץ אחר, בהתאם לטבלה זו. הסר את כל הבועות מהמערכת על ידי פתיחת כל תעלה בנפרד ומתן לתמיסה לזרום למשך מספר דקות. ודא שהזרימה עקבית והצינור אינו דולף.

לאחר מכן, התחבר למחמם התמיסה המוטבע היחיד לצינור יציאת הזלוף והתאם את הטמפרטורה של המאגר הזורם החוצה ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את משאבת היניקה. חבר את הצינור, הפעל את המשאבה וודא שהנוזל נשאב.

הנח את פלטפורמת ההדמיה עם האיים על המיקרוסקופ stage וחבר אותה למערכת הזלוף ולמשאבת היניקה. לאחר מכן, מלאו בעדינות את תא ההדמיה בתמיסה החוץ-תאית המכילה שלושה גלוקוז מילי-מולרי. כדי לבצע הדמיה קונפוקלית, אתר את האיים בשדה המיקרוסקופ בהגדלה נמוכה.

לאחר התמקדות באיים, עבור ליעדי הגדלה גבוהים יותר. פתח את תוכנת הרכישה והפעל את מצב הסריקה המקומי. בחר הדמיית xyzt, לאחר מכן כדי להגדיר את הגדרות הרכישה, הפעל את לייזר הארגון והגדר אותו ל-30% ולאחר מכן את קו הלייזר של 488 ננומטר, והתאם את עוצמת הלייזר לסביבות 50% עבור עירור pHluorin.

אסוף פליטה ב-505 עד 555 ננומטר, תוך שימוש בספקטרום הפליטה של EGFP כמדריך. בחר רזולוציה של 512 על 512 פיקסלים. התחל לצלם על ידי לחיצה על כפתור החי והתאם את רמות ההגברה.

הגדר את הקצה ההתחלתי של ערימת z על ידי התמקדות בחלק העליון של האי ובחירה בהתחלה ולאחר מכן מעבר למישור האחרון שניתן להתמקד בו ובחירה ב-n. בחר ערימת z בגודל של חמישה מיקרומטר. הגדר את מרווח הזמן לרכישה של כל ערימת z קרוב ל-1.5 עד 2 שניות ובחר באפשרות, רכוש עד לעצירה להדמיה רציפה.

לאחר מכן, לחץ על כפתור ההתחלה כדי לאתחל את ההדמיה. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרוטוקולי גירוי לגרימת אקסוציטוזיס גרגירים. באמצעות הסורק המקומי, תמונות קונפוקליות של האי מתקבלות כהקלטות זמן-lapse בפחות משתי שניות.

בנוסף, ניתן לשלב טכניקה זו עם צבעים להדמיה פונקציונלית, כמו צבעי סידן בעלי פוטנציאל ממברה או ציטוזולי. כדי לקבוע אם NP Y-pHluorin הוא אכן כלי מתאים לניטור דינמיקת גרגירי האינסולין, איים נגועים הוכתמו בנוגדנים נגד GFP עבור NP Y-pHluorin והורמוני האי אינסולין, סומטוסטטין או גלוקגון. רוב התאים המבטאים NP Y-pHluorin היו תאי בטא מכיוון שהם ביטאו גם אינסולין.

רק כמה תאי אלפא חיוביים לגלוקגון או תאי דלתא חיוביים לסומטוסטטין סומנו כ-GFP. חשוב לציין שבתאים נגועים, היתוך NP Y התמקם יחד עם אינסולין. איור זה מדגים כי pHluorin הוא חיישן pH יעיל.

שכן הגדלת ה-pH הבין-תאי עם אמוניום כלוריד של 50 מילי-מולרי הביאה לעלייה של יותר מ-500% בקרינה הבין-תאית. ככל שה-pH בתוך הגרגיר עולה עם היתוך עם קרום הפלזמה בפתח נקבוביות האיחוי, גרגירים המכילים NP Y-pHluorin נראים בתנאים המעוררים אקסוציטוזיס של אינסולין כגון דה-פולריזציה של הממברנה עם אשלגן כלורי. באמצעות הדמיית זמן-lapse קונפוקלית של איים נגועים ב-NP Y-pHluorin, ניתן לדמיין אירועי מזכירות בודדים בתאי בטא בתוך איים שלמים.

אלה מתרחשים בתגובה לדה-פולריזציה ישירה של הממברנה עם אשלגן כלורי או מספר גירויים פיזיולוגיים אחרים. בריכוז הגלוקוז החוץ-תאי הבסיסי נצפית פעילות מזכירה מועטה. עם זאת, היתוך גרגירים עם קרום הפלזמה מופעל בתגובה לגירוי עם גלוקוז גבוה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונוהיסטוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות כמו, מדוע איחוי גרגירים מתרחש באזורים ספציפיים של התא. לאחר פיתוחה, נעשה שימוש בטכניקה זו כדי לחקור את הדפוס הזמני של הפרשת גרגירי אינסולין באוכלוסיות תאי בטא, באיים אנושיים.