ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف التقدير الستيريولوجي القائم على التصميم لعدد الخلايا الدوبامينية في المادة السوداء (SN) لدى الفأر باستخدام معدات مجهرية قياسية. وتفيد هذه الطريقة في تقدير عدد العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء للفأر لأبحاث مرض باركنسون قبل السريرية باستخدام الستيريولوجيا غير المنحازة القائمة على التصميم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنفيذها باستخدام معدات مجهرية قياسية دون الحاجة إلى تجهيزات ستيريولوجية كاملة متوفرة تجارياً.

ستقوم لويزا فريز، الفنية من مختبري، باستعراض هذا الإجراء. ابدأ بوضع دماغ فأر مثبت بالبارافورمالدهيد في قالب تشريح الدماغ (brain matrix)، ثم قم بإجراء قطع على بُعد 0.74 millimeters من نقطة البريغما (bregma). انقل الجزء الذيلي من الدماغ، بما في ذلك المادة السوداء (SN)، إلى محلول 4%PFA بتركيز 0.1 molar، واتركه للتثبيت طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

في اليوم التالي، استبدل PFA بـ 30% sucrose في 0.1 molar PBS وحضن العينة لمدة يومين آخرين عند درجة حرارة أربع درجات Celsius لتوفير الحماية من التجمد للعينة. وبعد مرور يومين، وعندما يغوص الدماغ في السكروز، ضع النسيج في Cryomold مملوء بمركب optimal cutting temperature compound وجمّد النسيج ببطء في isopentane مبرد بالثلج الجاف السائل. استخدم جهاز cryostat لعمل قطاعات متسلسلة بسماكة 30 micron في المستوى الإكليلي.

حدد نصف الكرة المخي الأيمن عن طريق ثقب فتحة صغيرة في المنطقة العلوية من جذع الدماغ. اجمع أربع مجموعات من المقاطع بدءاً من 2.46- ملم من البريغما (bregma) وانتهاءً بـ 4.04 ملم من البريغما. انقل كل مجموعة من المقاطع إلى أنبوب مملوء بمادة واقية من التجميد واحفظها في درجة حرارة 20- درجة مئوية.

التقط صوراً رقمية لمقاطع المادة السوداء (SN) المصبوغة كيميائياً نسيجياً لإنزيم tyrosine hydroxylase باستخدام برنامج تصوير متصل بمجهر. ابدأ بتحديد مقدار التثبيت الفعلي وسماكة المقاطع في ثلاثة مواقع عد مختارة عشوائياً لكل مقطع. انقر أولاً على "view top offset" لتحديد الجزء العلوي من المقطع.

بعد ذلك، انقر فوق إيقاف عرض الأعلى. ثم انقر فوق إزاحة عرض الأسفل، ثم انقر فوق إيقاف عرض الأسفل. دوّن سُمك المقطع.

احسب منطقة الحماية بطرح 3 microns من الإزاحة العلوية (top offset) واكتب النتيجة في مربع الإزاحة العلوية. بعد ذلك، اطرح ارتفاع المقطع البصري البالغ 13 micron من رقم الإزاحة العلوية واكتب النتيجة في مربع الإزاحة السفلية (bottom offset). اختر المعلمات التالية: الخطوات 14، والحجم 1.00.

اختر الدليل لحفظ الملف. انقر على sequence لبدء عملية الاستحواذ. بعد استحواذ الصور، انقر على processing واختر المعاملات التالية: all planes from sequence، وmontage، ومربعات fast وstitching مع تداخل صور بنسبة 10%. ابدأ في دمج الصور بالنقر على start.

سيؤدي ذلك إلى إنشاء صور مكدسة (stack images) للتحليل. للبدء، افتح الصورة من خلال النقر على "file" ثم "open". قم بتحديد مقياس الصورة باستخدام أمر "analyze" ثم "set scale".

بدءاً من هذه الخطوة، قم بتغيير الحجم المحدد من البكسل إلى الميكرون. اختر قائمة plugins ثم grid ثم أمر grid type lines لإدراج شبكة بشكل عشوائي. قم بتفعيل مربع الاختيار random offset.

حدد حجم المربع الواحد داخل الشبكة بـ 130 microns في 130 microns ليكون مساوياً لـ 16,900 square microns. قم بتغيير نوع الصورة من 16-bit إلى RGB color من خلال النقر على image ثم type ثم RGB color. حدد موقع substantia nigra pars compacta.

قم بتحديد المنطقة باستخدام أداة فرشاة الرسم (paintbrush tool) بعرض فرشاة قدره 11. قم بإلغاء أمر ضبط المقياس (set scale) عن طريق النقر على analyze ثم set scale ثم النقر على remove scale للحساب بالبكسل بدلاً من الميكرون. التقط لقطة شاشة، واحفظ ملف الصورة ثم افتح الملف الجديد باستخدام برنامج ImageJ.

اختر فرشاة (brush) وعرض فرشاة يبلغ 25. حدد كل مربع من مربعات الشبكة الذي يتلامس مع الـ SN لوضع المقطع البصري (optical dissector). اختر مربعاً واحداً من مربعات الشبكة يتضمن أجزاءً من الـ SN. قم بقياس الزاوية العلوية اليسرى للمربع باستخدام المؤشر في برنامج ImageJ لتحديد إحداثيات x و y للبداية.

اختر قالب جدول البيانات المعنون بوضعية المقطع البصري (optical dissector position) واحسب وضعية المقطع البصري. ثم قم بتقدير عدد الخلايا باستخدام جدول بيانات حساب تعداد الخلايا كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول. تُظهر هذه الصورة منخفضة التكبير مقطعاً من دماغ فأر بعد صبغة TH للخلايا العصبية الدوبامينية.

يوضح التكبير الأعلى العصبونات الدوبامينية الموجبة لـ TH. ويظهر الشكل المدرج المنطقة المحددة بمربع بتكبير متزايد. تعرض هذه الصورة سلسلة واحدة من مقاطع SN المصبوغة بـ TH تغطي كامل منطقة SN في الفأر من الناحية المنقارية إلى الناحية الذيلية.

يتم الفصل بين كل مقطع والمقطع الذي يليه بمسافة 120 microns. تم تقدير عدد العصبونات الموجبة لـ TH في المادة السوداء (SN) للفأر في الجانبين الأيمن والأيسر باستخدام الطريقة الموضحة في هذا الفيديو وباستخدام نظام ستيريولوجيا متاح تجارياً. وكما يتضح هنا، فقد أدت كلتا الطريقتين إلى تعدادات خلوية متقاربة، ولم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين مجموعات البيانات.

لا تنسَ أن العمل مع البارافورمالديهايد قد يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية مثل القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تقدير ستيريولوجي غير متحيز لعدد العصبونات الدوبامينية في المادة السوداء للفأر باستخدام طريقة الكسر البصري ومعدات المجهر القياسية.