التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

الهدف العام من هذا البروتوكول هو اشتقاق خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات متجانسة. يمكن استخدام هذه الطريقة لاشتقاق الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات لأغراض عديدة، بما في ذلك نمذجة الأمراض، أو فحص العقاقير، أو اشتقاق خلايا لتجارب العلاج الخلوي قبل السريرية. تكمن ميزة هذا البروتوكول في كونه منهجاً قوياً ينتج خلايا متجانسة يتم الحفاظ عليها في نظام استزراع سهل الاستخدام، وخالٍ من المكونات الحيوانية الغريبة (Xeno-free)، ومحدد كيميائياً بالكامل.

بما أن الخلايا الجذعية البشرية المستحثة وافرة القدرة (iPS cells) تحاكي الخلفية الجينية للأنسجة المانحة، ويمكن تمايزها إلى أي نوع من الخلايا ذات الصلة بالمرض، فهي توفر أدوات ممتازة لنمذجة الأطروحات العلمية. وتعد عملية تشريح الخزعة والتقاط المستعمرات من الإجراءات المعقدة؛ لذا فإن رؤيتها وهي تُنفذ بأيدٍ خبيرة تساعد في فهم هذه الإجراءات وتجعل تكرارها أكثر سهولة.

ستقوم هارييت رون هولم وكيللي داي، وهما فنيتان مخبريتان ذوات خبرة عالية من مرفق نواة الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (iPS Core Facility) في معهد كارولينسكا، بشرح الإجراء اليوم. يمكن تخزين عينات خزعة الجلد في محلول PBS مضاف إليه 1% penicillin streptomycin لمدة تصل إلى 48 ساعة في درجة حرارة 4 °C، ولكن يجب معالجتها بأسرع ما يمكن بعد الحصول عليها. انقل الخزعة إلى طبق قطر 35 millimeter.

اغمر خزعة الجلد في طبق قطرُه 35 مليمتر يحتوي على 2 مل من الإيثانول بتركيز 70% لمدة 30 ثانية. أضف 1 مل من محلول هانك الملح الموازن (Hank's Balanced Salt Solution) المعقم والمُدعم بـ 1% بنسيلين ستريبتومايسين إلى طبق جديد قطرُه 35 مليمتر، ثم انقل الخزعة إلى الطبق الجديد. انقل الخزعة إلى طبق رابع قطرُه 35 مليمتر مملوء بـ 1 مل من محلول الدسباز (dispase) بتركيز 0.1% المُحضّر حديثاً.

باستخدام مشارط جراحية وملاقط معقمة، قم بتقطيع خزعة الجلد إلى قطع يتراوح حجمها من واحد إلى اثنين مليمتر مكعب. انقل قطع الخزعة مع محلول dispase إلى أنبوب سعة 15 milliliter وأضف مليليترين إضافيين من dispase. اشطف الطبق سعة 35 millimeter بواحد milliliter من محلول dispase وانقل المحلول الناتج عن الشطف إلى أنبوب الـ 15 milliliter.

يُحضن العينة الخزعية عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، يُضاف 4 mL من collagenase I بتركيز 0.1% إلى الأنبوب الذي يحتوي على قطع الخزعة، ثم تُحضن عند درجة حرارة 37 °C لمدة أربع ساعات. وقبل ثلاثين دقيقة من استزراع الخلايا، تُطلى عين واحدة في طبق زراعة أنسجة مكون من ست عيون بـ 1 mL من الجيلاتين بتركيز 0.1% في محلول DPBS.

تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وبعد أربع ساعات من التحضين مع الكولاجيناز (collagenase)، تُفصل الخلايا المهضومة بجهاز الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. يتم سحب السائل الطافي وإعادة تعليق المادة المهضومة في 2 mL من وسط نمو الخلايا الليفية (fibroblast medium).

أزل محلول الجيلاتين من طبق زراعة الأنسجة ذي الستة آبار المُعد مسبقاً. انقل معلق الخلايا، بما في ذلك أي قطع نسيجية متبقية، إلى الطبق ذي الستة آبار. قم بتحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide في رطوبة عالية.

تكون الخلايا الليفية (Fibroblasts) جاهزة للنقل إلى قارورة زراعة أنسجة T25 عندما تصل نسبة الالتحام إلى 80%. وتعتبر الخلايا الليفية في الممرات من الثاني إلى الرابع هي الأمثل لإعادة البرمجة، حيث تكون كفاءة إعادة البرمجة عمومًا أعلى في الخلايا الليفية ذات الممرات المنخفضة. اسحب وسط زراعة الخلايا من القارورة واغسل الخلايا باستخدام 1 mL من DPBS.

قم بسحب محلول DPBS وإضافة 1 ml من 0.5% Trypsin EDTA. يتم التحضين عند 37 °C لمدة خمس دقائق أو حتى تنفصل الخلايا. أضف 2 ml من وسط نمو الخلايا الليفية (fibroblast medium)، وأعد تعليق الخلايا، ثم انقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ml.

قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 2 mL من وسط زراعة الخلايا الليفية. بعد عد الخلايا الليفية باستخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer)، ازرع 5 × 10⁴ خلية في بئر واحدة من طبق زراعة أنسجة يحتوي على 24 بئراً.

قم بتحضين الخلايا عند 37 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، وبسبب التعامل مع فيروس Sendai، استكمل الإجراء في مختبر مصنف BSL-2 مع استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. اسحب وسط زراعة الخلايا وأضف 250 µL من محلول فيروس Sendai.

قم بحضن الطبق عند 37 °C. وقبل يوم واحد من اختيار المستعمرات، قم بتجهيز أطباق زراعة الأنسجة ذات 24 بئرًا والمطلية بـ LN-521. انقل 250 µL من محلول LN-521 بواسطة الماصة إلى بئر واحد من الطبق ذو الـ 24 بئرًا.

قم بتغطية الطبق باستخدام شريط البارافيلم (parafilm) واحضنه عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. في اليوم التالي، قم بسحب محلول LN-521 من البئر الواحد في طبق الـ 24 بئرًا، وأضف 500 µL من وسط E8 إلى البئر. يُوصى باستخدام غطاء شعر وقناع وقائي أثناء عملية التقاط المستعمرات تحت المجهر المجسم (stereo microscope).

تكون المستعمرات جاهزة للنقل عندما يتجاوز قطرها 1 mm، وتظهر حواف حادة، وتنمو في طبقات أحادية متجانسة. تجنب نقل المستعمرات ذات الحدود غير الواضحة والكتل الخلوية الكبيرة غير المتماسكة وغير المتجانسة. قم بتقطيع كل مستعمرة باستخدام مشرط إلى قطع أصغر وفق نمط شبكي.

استخدم ماصة سعة 200 µL لكشط صفائح الخلايا ميكانيكياً من الطبق، ثم انقل الصفيحة إلى فجوة في لوحة زراعة أنسجة ذات 24 فجوة كانت قد غُطيت مسبقاً بـ LN-521. يعد اختيار المستعمرات أمراً حاسماً لنجاح هذا البروتوكول؛ لذا فإن اختيار بضع مستعمرات إضافية سيضمن الالتصاق بأعداد كافية.

اترك الخلايا لتلتصق دون تغيير وسط E8 لمدة 48 ساعة. قم بتمرير الخلايا إنزيمياً عندما تصل المستعمرات إلى حجم أكبر من خمسة مليمترات. اشفط وسط زراعة الخلايا من فوق الخلايا واغسلها باستخدام 250 µL من DPBS.

قم بشفط محلول DPBS وأضف 250 µL من كاشف التفكيك. احضن العينة عند درجة حرارة 37 °C لمدة ثلاث دقائق. لاحظ أن الخلايا قد بدأت في الاستدارة.

افصل الخلايا عن الطبق عن طريق شطفها بكاشف التفكيك. أضف 500 µL من وسط E8 إلى أنبوب سعة 15 mL، ثم انقل الخلايا وكاشف التفكيك إلى الأنبوب. قم بالطرد المركزي عند 300 ×g لمدة ثلاث دقائق.

قم بشفط السائل الطافي من أنبوب سعة 15 milliliter وأعد تعليق كتلة الخلايا في 500 microliters من وسط E8. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemacytometer) وازرع من 2.5 إلى 5 × 10⁴ خلية في بئر آخر مجهز مسبقاً ومطلي بـ LN-521 يحتوي على 500 microliters من وسط E8 في درجة حرارة الغرفة. أضف مثبط ROCK ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 micromolar.

قم بحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الليفية المنقولة في اليوم 12 تقريبًا بعد عملية النقل. وتكون المستعمرات جاهزة للاختيار بعد حوالي ثلاثة إلى أربعة أسابيع من عملية النقل.

تشمل السمات المفضلة كتلًا خلوية مدمجة ومسطحة، والنمو في طبقات أحادية متجانسة، وحواف حادة. تُظهر صور المجال المضيء هذه خط خلايا iPS بشرية مبرمجة بالكامل ومتجانسة في ممر مبكر مقارنة بخط خلايا غير متجانس للغاية. تم تأكيد فقدان ناقل فيروس Sendai من خلال غياب العلامات الخاصة بناقل فيروس Sendai في خلايا iPS البشرية عند الممر 12، وذلك على عكس خلايا iPS البشرية عند الممر الثالث.

أظهر صبغ الكيمياء النسيجية المناعية للخلايا المشتقة لعلامات تعدد القدرات OCT4 وSSEA-4 وNANOG نتيجة إيجابية متجانسة. كما تم إثبات التعبير عن mRNA لجينات تعدد القدرات الداخلية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنسخ العكسي (reverse transcriptase PCR). وقد تم استبعاد المزارع الخلوية التي تحتوي على خلايا أعيدت برمجتها جزئيًا ولم تعبر عن عوامل تعدد القدرات.

تم تقييم إمكانية التمايز لخلايا iPS البشرية عن طريق تكوين الأجسام المضغية. وقد كشف تحليل PCR في الوقت الحقيقي بعد 21 يوماً من تمايز الأجسام المضغية عن تعبير mRNA للمؤشرات الخاصة بالأديم الباطن، والأديم المتوسط، والأديم الظاهر، مما أكد أن خلايا iPS البشرية المشتقة قادرة على التمايز إلى الطبقات الجرثومية الثلاث. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون حوالي 22 ساعة من العمل التطبيقي خلال فترة زمنية تبلغ 16 أسبوعاً تقريباً.

يمكن تمايز الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات المشتقة إلى أي نوع من خلايا جسم الإنسان البالغ للإجابة على أي تساؤلات ذات صلة بمجال بحثك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهماً جيداً لكيفية تنفيذ الخطوات اللازمة لاشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من خزعات الجلد.