一种从任意 DNA 源进行大规模 gRNA 库生产的通用协议

该方法的总体目标是从任何来源的纯化 DNA 构建全面的向导 RNA 文库。gRNA 文库是基于 CRISPR 的筛选中使用的质粒集合。CORALINA 方法使用纯化 DNA 的酶消化将所得片段克隆到向导 RNA 文库骨架中。

该技术的主要优点是它从输入序列中产生所有可能的向导 RNA，并且非常具有成本效益。虽然该视频演示了 CORALINA 文库对细菌人工染色体的保护，但该方法原则上可以应用于来自任何生物体的任何类型的输入 DNA。必须对每批新批次的微球菌核酸酶进行微球菌核酸酶消化优化。

为每个反应设置以下内容。1 μL 10x 微球菌核酸酶缓冲液、1x 牛血清白蛋白、1 μg 靶 DNA、1 μL 微球菌核酸酶和 10 μL 水。在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。

立即加入 1 微升 500 毫摩尔 EGTA 灭活酶。向 DNA 样品中加入含有凝胶上样染料的样品缓冲液，并在 20% 聚丙烯酰胺凝胶中每孔加载 1 μg DNA。加载合适的 DNA 分子量标准进行分子量测定。

在 150 伏特的 1x TBE 电泳缓冲液中电泳约 1.5 小时，或直到染料前沿下部到达凝胶的下端。使用超灵敏核酸染色剂对凝胶进行染色，并在紫外光下观察。在这个例子中，将 DNA 消化至 20 至 30 个碱基对的微球菌核酸酶的最佳浓度为 10 个单位。

使用此最佳浓度的微球菌核酸酶消化 10 至 12 μg 目标 DNA，方法与优化反应中所示的方法相同。通过 PAGE 分离 DNA 片段后，使用无菌手术刀在标记泳道旁边切割凝胶，并仅用含有超敏感核酸染料的新鲜 1x TBE 电泳缓冲液对含有分子量标准品的凝胶部分进行染色。观察 DNA 分子量标准，并使用剃须刀片切除微球菌核酸酶消化的 DNA 片段，大小范围约为 18 至 30 个碱基对。

将凝胶切片转移到微量离心管中。如前所述，用核酸染色剂对凝胶的其余部分进行染色。将凝胶暴露在紫外线下并获取图像作为凝胶切除步骤的记录。

通过使用无菌移液器吸头将切除的凝胶切片压碎在微量离心管壁上来开始此过程。加入两块凝胶体积的 PAGE 增溶缓冲液，并在 37 摄氏度下在旋转平台上孵育 16 小时。第二天，在微量离心机中以最大速度离心样品 1 分钟。

将上清液转移到新的微量离心管中，注意不要转移任何压碎的凝胶块。向凝胶沉淀中加入 0.5 体积的 PAGE 增溶缓冲液，涡旋并重复离心。合并上清液并使用文本方案中所述的标准苯酚-氯仿提取方法提取 DNA 片段。

分离 DNA 片段的同时，使用标准 PCR 从向导 RNA 表达载体中扩增接头。为确保定向克隆，然后按照文本方案中的说明用适当的限制性内切酶消化接头。在 1% 琼脂糖凝胶上运行接头的限制性内切酶消化物。

切除正确的条带，并使用凝胶提取试剂盒从切除的凝胶片段中纯化 DNA。DNA 平端试剂盒用于末端修复反应。将以下内容加入微量离心管中。

10 μL 纯化的 DNA、1.5 μL 10x 平端缓冲液、1.5 μL 1 毫摩尔 dNTP 混合物、1.4 μL 水和 0.6 μL 平端酶。在 22 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在 70 摄氏度下孵育 10 分钟加热并激活酶。加入 85 微升水，并按照文本方案中的说明进行反应净化。

使用等摩尔量的微球菌核酸酶消化和修复片段和接头序列构建 14 μL 连接反应，如文本方案中所述。缺口平移后，连接产物通过 PCR 扩增。要将具有正确连接的 5 个引物和 3 个引物接头的微球菌核酸酶片段与具有两个 5 引物或两个 3 个引物接头的片段分离，请合并所有 15 个循环的 PCR 反应，添加 DNA 上样染料并在 0.8% 琼脂糖凝胶上运行。

切除 869 个碱基对的突出条带，并使用凝胶提取试剂盒纯化 DNA。使用分光光度计定量 DNA 的量。随后，通过 Gibson 组装将 PCR 扩增的片段克隆到向导 RNA 表达载体中，如文本方案中所述。

要开始此过程，将纯化的载体插入体等分到无菌和预冷的 PCR 管中并保持在冰上。在冰上冷却 1 毫米间隙的电穿孔比色皿。将 25 μL 新鲜制备的 TG1 细胞直接加入到一份 DNA 中，并立即将混合物转移到电穿孔比色皿中。

轻弹或轻敲比色皿，确保细胞和 DNA 混合物沿比色皿腔室的长度分布，没有任何滞留的空气或气泡。将比色皿放入载玻片腔中并启动适当的电穿孔程序。立即向比色皿中加入 475 μL 室温 2TY。

将电穿孔的细菌转移到 50 毫升试管中。重复单个电穿孔，将用一个文库转化的所有细胞收集在一个 50 ml 试管中，并记录总体积。为了估计整个文库的菌落总数，将确定的少量细菌与文库一起接种在 10 厘米琼脂平板上，并选择合适的抗生素。

为了减少剩余细菌的体积，以大约 4， 000 g 离心 10 分钟，或直到形成可见的调色板并且上清液看起来清晰。除几毫升外，除去所有上清液并重悬细胞。将细菌接种到含有适当抗生素选择的 2TY 琼脂包被的生物测定皿上。

将适当体积的 pUC19 对照电穿孔反应物涂布在另外的 10 厘米琼脂培养皿上，并选择适当的抗生素。将琼脂平板在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，计算对照平板上的菌落数，以估计细菌每微克 DNA 的菌落形成单位以及文库复杂性。

最后，从板中刮下细菌以进行质粒 DNA 提取。凝胶纯化后，将 1/6 纯化的微球菌核酸酶片段上样到 20% PAGE 凝胶上，以确认大小选择和纯化成功。用限制性内切酶消化接头扩增子，以确保接头以正确的方向连接到微球菌核酸酶消化的片段上。

该代表性凝胶图像的左侧分别显示了 HindIII 和 SacII 消化前后的 5 个引物和 3 个引物接头，表明接头完全消化为预测性的 637 个碱基对和 295 个碱基对。凝胶图像的右侧记录了消化的连接片段的切除过程。使用 PCR 分析接头与 DNA 片段的成功连接，并增加 PCR 循环数。

包括的对照是使用上一个缺口平移步骤中的无模板对照作为输入的无模板对照和无微球菌核酸酶片段对照。只有微球菌核酸酶片段与接头 DNA 结合的样品才能产生预期的 869 个碱基对扩增子。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在五天内完成。

在尝试此过程时，保持文库的复杂性并执行其他对照反应非常重要。观看此视频后，您现在应该对如何通过将 DNA 切成小片段并将其克隆到文库载体骨架中来生成用于基于 CRISPR 的筛选的向导 RNA 文库有了很好的了解。