Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

الحقن المجهري لبروتين CRISPR / Cas9 في قناة سمك السلور ، أجنة Ictalurus punctatus لتحرير الجينات. يعد تطوير بروتوكول موثوق وفعال لتحرير الجينات المستهدف في سمك السلور في قناة القرموط أمرا بالغ الأهمية لدراسة علم الجينوم الوظيفي. خاصة بعد إثراء الموارد الجينومية من خلال تسلسل جينوم سمك السلور القناة.

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 في سمك السلور القناة. تم تطوير هذا البروتوكول والتحقق من صحته من خلال استهداف جينين مرتبطين بالمناعة لسمك السلور. مجال مستقبلات Toll / interleukin-1 الذي يحتوي على جزيء محول ، أو جين TICAM1 ، والليكتين المرتبط بالرامنوز أو جين RBL.

تم تنفيذ جميع الإجراءات في وحدة أبحاث علم الوراثة السمكية التابعة لمركز أبحاث مصايد الأسماك EW Shell في جامعة أوبورن في ألاباما. اختيار مخزون الحضنة والتفريخ. اختر مخزون حضنة سمك السلور الصحي من سلالة أو خط جيني ترغب في تعديله.

يجب أن يظهر ذكور وإناث سمك السلور خصائص جنسية ثانوية جيدة. اختر الذكور الذين لديهم رأس عضلي عريض أعرض من بقية أجسامهم مع حليمة تناسلية متطورة. اللون الداكن والجروح الندبة من القتال الإقليمي هي أيضا علامات على الاستعداد الجنسي.

اختر الإناث اللواتي لديهن رؤوس أضيق من بقية أجسادهن ولديهن بطن ناعم وملموس ومستدير. من أجل الدقة وتجنب إجهاد الأسماك أثناء المناولة الأولية ، توقف عن إطعام الإناث قبل يومين إلى ثلاثة أيام من فحص استعدادها للتفريخ. يجب أن يتم التعامل مع الأسماك بسرعة ولكن بعناية لتقليل إجهاد المناولة.

يجب أن تتم جميع الإجراءات التي تتطلب التعامل مع الإناث أثناء الاحتفاظ بالأسماك في أكياس التفريخ. قبل حقن الهرمونات مباشرة ، احصل على وزن جسم الإناث. يمكن بعد ذلك تعليق أكياس التفريخ مع الإناث بداخلها في خزان متدفق مع تدفق مستمر للمياه والتهوية الكافية.

قم بتحميل جهاز الزرع الذي يحتوي على إبرة قياس 14 معقمة مع 85 ميكروغراما لكل كيلوغرام من الهرمون الملتوني الذي يطلق الهرمون التناظري. LHRHA. اشطف موقع الحقن والعضلات الظهرية بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ قبل الحقن. أدخل الغرسة بزاوية 45 درجة وحرر الغرسة.

اسحب الإبرة وامسح موقع الحقن بقطن مبلل مسبقا في 70٪ من الإيثانول. ضع كيس التفريخ في الخزان حتى تغمر الأسماك بالكامل في الماء من 15 إلى 20 سم تحت سطح الماء. التهوية الكافية بما في ذلك خمسة أجزاء أو أكثر في المليون من الأكسجين المذاب ، وجودة المياه الجيدة مهمة لإباضة البويضات عالية الجودة.

توقع وقت الإباضة بناء على درجة حرارة الماء باستخدام علاقة الدرجة والساعة. عادة ما يتم إجراء الفحص الأول للبويضات بعد حوالي 36 ساعة من حقن الهرمونات ثم كل أربع ساعات. للتحقق من الإباضة ، ارفع كيس التفريخ برفق فوق سطح الماء أثناء البحث عن البيض المتصل بداخل الكيس.

عندما ترى البيض على الأقل 10 أو نحو ذلك ، تكون هذه الأنثى في مرحلة الإباضة وجاهزة لتجريد اليد. تحضير المنوية. يمكن تحضير المنوية قبل ساعات قليلة من وقت الإباضة المتوقع.

يتم القتل الرحيم للأسماك الذكور ويتم جمع الخصيتين في وعاء وزن صغير. تحديد وزن الخصيتين. قم بإزالة أي منديل واغسل الخصيتين بمحلول ملحي 0.9٪ لإزالة الدم إذا لزم الأمر.

الخصيتين المتطورة بيضاء مع العديد من الإسقاطات الزغابية. سحق الخصيتين وتصفية المنوية باستخدام شبكة 100 ميكرون. استخدم محلول ملحي 0.9٪ لغسل المنوية من الشبكة إلى أنبوب سعة 50 ملليلترا.

يمكن إضافة المحلول الملحي حتى 10 ملليلتر لكل جرام من الخصيتين. تحديد تركيز المنوية. تحقق من الحركة والجدوى.

ومع ذلك ، بالنسبة لهذه الإجراءات ، هذا ليس ضروريا إذا كانت الخصيتان متطورة بشكل جيد. يمكن بعد ذلك تخزين المنوية عند أربع درجات مئوية ويجب استخدامها في غضون 24 ساعة بعد التحضير. جمع البويضات والتخصيب.

ضع طبقة رقيقة جدا من السمن النباتي على صينية تفريخ جافة ونظيفة قطرها 20 سم. ضع الأنثى في محلول مخدر يحتوي على 100 جزء في المليون من ميثان سلفونات التريكائين المخزنة مع بيكربونات الصوديوم حتى يتم تخدير الأسماك تماما. أخرج السمك بحذر من كيس التفريخ واغمسه في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ لغسل المخدر.

جفف السمك تماما باستخدام منشفة نظيفة مع تجنب إزالة الطبقة المخاطية على سطح جسم السمكة. ضع السمن النباتي على المنطقة المحيطة بفتحة التهوية بما في ذلك زعانف الحوض لتثبيت البيض أثناء تجريد اليد. قم بتجريد البيض يدويا في مقلاة التفريخ المدهونة بالزبدة عن طريق الضغط برفق على المبايض.

يجب أن يتدفق البيض الجيد بحرية ، وأن يكون لونه أصفر ذهبي ويحتوي على كتل أو جلطات دموية ضئيلة أو معدومة. تجنب ملامسة البويضات والماء قبل الإخصاب لأن الماء يمكن أن يحفز إغلاق الميكروبيل. لتخصيب البيض للحقن الدقيق ، انقل إلى 200-300 بيضة إلى مقلاة تفريخ مدهونة بالزبدة.

أضف ملليلترا إلى ملليلترين من محلول المنوية إلى البويضات واخلطها برفق. أضف الماء العذب إلى البويضات لتنشيط المنوية والبويضات. يجب إضافة كمية كافية من الماء لتغطية البيض قليلا.

حرك البيض برفق لمدة 30 ثانية. يجب أن يحدث الإخصاب في دقيقة إلى دقيقتين. من المهم تسميد البيض في طبقة واحدة.

يلتصق بيض سمك السلور ببعضه البعض مما يجعل من الصعب حقن طبقات متعددة من الأجنة بشكل دقيق. أضف المزيد من الماء العذب إلى البيض المخصب واترك البيض يتماسك لمدة 10 إلى 15 دقيقة. يمكن تغطية البويضات غير المخصبة المتبقية بمنشفة مبللة لمنع الجفاف ويمكن تخصيبها على مدى بضع ساعات.

يمكن أن يتم الإخصاب بطريقة متداخلة. يمكن تخصيب دفعة واحدة من اثنين إلى 300 بويضة كل 30 إلى 60 دقيقة لضمان الإمداد المستمر للأجنة في مرحلة الخلية الواحدة للحقن الدقيق والتحكم في الأجنة غير المحقونة. سحب وإبرة التحميل.

اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية OD ملليمترية واحدة إلى إبرتين. قم بتخزين الإبر في صندوق ورقي به قطعة من الإسفنج تم عمل عدة شقوق فيه. لتجنب كسر الإبرة ، يجب أن يكون قطر الإسفنجة أصغر من طول جذع الإبرة.

يمكن بعد ذلك فتح طرف الإبرة عن طريق كسر قطعة صغيرة من الإبرة في أرقى منطقة باستخدام أداة حادة. بدلا من ذلك ، يمكن فتح الإبرة عن طريق الضغط على أنحف منطقة من الطرف باستخدام زوج من الملقط تحت المجهر. تحضير محلول الحقن عن طريق خلط الحمض النووي الريبي الإرشادي مع بروتين Cas9.

يمكن إضافة الفينول الأحمر لتلوين دليل RNA Cas9 مزيج البروتين ، حيث يشكل الفينول الأحمر ما يصل إلى ثلث الحجم الإجمالي. ثم يحضن الخليط لمدة 10 دقائق على الثلج قبل الاستخدام. باستخدام اللودر الصغير ، قم بتحميل 5-10 ميكرولتر من خليط دليل RNA Cas9 في إبرة الحقن.

عن طريق إدخال اللودر الصغير في جذع الإبرة وطرد الخليط ببطء أثناء سحب طرف اللودر الصغير. تجنب حبس فقاعات الهواء بالداخل. قم بتوصيل الإبرة بحامل الماصة الصغيرة وتأكد من التوصيل المحكم.

ثم قم بإرفاق الحامل بالمناور الصغير. ضمان حرية الحركة ومستقرة. قم بالضغط على الحقن الدقيق عن طريق فتح أسطوانة النيتروجين وضبط منظم الضغط.

يمكن أن يتأثر حجم الحقن بالضغط وقطر فتحة الإبرة ومدة الحقن. لتحديد الحجم الذي ترغب في حقنه ، قم بحقنه في قطرة من الزيت المعدني موضوعة على مقياس كثافة الدم. إذا لزم الأمر ، يمكن ضبط الضغط وقطر الإبرة لزيادة أو تقليل حجم الحقن.

حقن الزيت المعدني عدة مرات لضمان حجم ثابت. الحقن الدقيق لأجنة سمك السلور. ضع طبقة رقيقة جدا من السمن النباتي على طبق بتري نظيف 100 ملم.

انقل 50 إلى 100 بيضة من مقلاة التسميد إلى طبق بتري وقم بتغطيتها بمحلول هولتفريتر. يجب محاذاة البيض ضد بعضهما البعض في طبقة واحدة. يجب أن تثبت هذه المحاذاة البيض في مكانه أثناء عملية الحقن الدقيق.

ضع طبق بتري مع البيض على منصة المجهر وامسكه بيد واحدة. اخفض الإبرة باليد الأخرى حتى تخترق المشيمة وصفار البيض بحركة واحدة سلسة. يجب أن يكون طرف الإبرة قريبا قدر الإمكان من القرص الأريمي قبل تسليم مادة الحقن.

اضغط على الدواسة وقم بتوصيل مادة الحقن إلى صفار البيض. إذا لم يكن القرص الأريمي مرئيا بوضوح ، فيمكن أن تنتشر مادة الحقن في مواقع مختلفة في جميع أنحاء صفار البيض. للقيام بذلك ، يتم إدخال الإبرة في الطرف البعيد من صفار البيض.

ثم اضغط على الدواسة واسحب الإبرة في وقت واحد. هذا ينتشر مواد الحقن في مواقع مختلفة في جميع أنحاء صفار البيض. يمكن حقن 50 نانولترا تحتوي على 2.5 نانوجرام من الحمض النووي الريبي الإرشادي و 7.5 نانوجرام من بروتين Cas9 في صفار البيض دون أي مشاكل.

اسحب الإبرة بسلاسة حتى لا تتلف البيضة. ثم انقل طبق بتري لحقن بيضة أخرى بنفس الإجراء. تجنب حركة طبق بتري أثناء عملية الحقن لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف البويضة أو كسر الإبرة.

قم بإزالة البويضات الممزقة أو التالفة بسبب الحقن المجهر. يمكن أن يبدأ الحقن بعد 15 إلى 20 دقيقة من الإخصاب ، ويستمر طالما أن الأجنة لا تزال في مرحلة الخلية الواحدة. يتم وضع الأجنة المحقونة مرة أخرى في محلول هولتفريتر مع 10 جزء في المليون من الدوكسيسيكلين والتهوية المستمرة لمدة ستة إلى سبعة أيام حتى الفقس.

يتم تغيير المحلول يوميا وإزالة الأجنة الميتة. النتائج. يوضح هذا الشكل الطفرات المستحثة ب CRISPR / Cas9 في جين TICAM1 لسمك السلور القناة. يمثل التسلسل الأزرق الشكل المجاور للفاصل الأولي أو PAM ، بينما يمثل التسلسل الأخضر هدف الحمض النووي الريبي الموجه.

كان من المتوقع حدوث كسر خيط مزدوج ناتج عن بروتين Cas9 في موقع المثلثين الأحمرين. يتم تمثيل طفرات الحذف بخط شرطة ، حيث تتوافق كل شرطة مع نيوكليوتيدات تم حذفها. التسلسلات الحمراء هي إدخالات بينما يمثل اللون الأرجواني طفرة الاستبدال.

تمثل كسور 78 عدد الأليلات المتحولة في 78 تفاعلا تسلسليا. على سبيل المثال ، يعني 3/78 أنه تم اكتشاف أليل في ثلاثة تفاعلات تسلسل من إجمالي 78 تفاعلا. كان معدل الطفرة 79.2٪ في 24 فردا تم تحليلهم.

أدت الطفرات إلى إزالة عدد قليل جدا من الأحماض الأمينية من البروتين ، وتغيير إطار القراءة النهائية والإنهاء المبكر للترجمة. في معظم الطفرات ، تم اقتطاع أكثر من 80٪ من تسلسل البروتين المتوقع ل TICAM1 بسبب كودون التوقف المبكر. يوضح هذا الشكل الطفرات المستحثة ل CRISPR / Cas9 في جين RBL لسمك السلور القناة.

التسلسلات الخارجية هي أحرف كبيرة بينما التسلسلات الداخلية هي أحرف صغيرة. تمثل التسلسلات الزرقاء الشكل المجاور للفاصل الأولي بينما يمثل التسلسل الأخضر هدف الحمض النووي الريبي الموجه. كان من المتوقع حدوث كسر خيط مزدوج ناتج عن بروتين Cas9 في موقع المثلثين الأحمرين.

يتم تمثيل طفرات الحذف بخط شرطة تتوافق فيه كل شرطة مع نيوكليوتيدات تم حذفها. التسلسلات الحمراء هي إدخالات. تمثل كسور 40 عدد الأليلات المتحولة في 40 تفاعلا تسلسليا.

على سبيل المثال ، يعني 2/40 أنه تم اكتشاف أليل في تفاعلين متسلسلين من إجمالي 40 تفاعلا. كان معدل الطفرات 87.5٪ في 40 فردا تم تحليلهم. تتراوح عمليات الحذف من خمسة أزواج أساسية إلى 183 زوجا أساسيا بينما تم إدخال ما يصل إلى 20 زوجا أساسيا.

نتج عن أكثر من 70٪ من indels بروتين مقطوع كان 10٪ أو أقل من طول البروتين من النوع البري. في هذا الفيديو ، أوضحنا كيفية حقن بروتين CRISPR / Cas9 في أجنة سمك السلور ذات قناة خلية واحدة. الإجراءات الموصوفة بسيطة وسريعة وفعالة.

ونجحت في تحقيق الضربة القاضية الجينية في جينات سمك السلور ذات القناتين. TICAM1 و RBL. اعتمادا على ما يتم حقنه ، يمكن تعديل البروتوكول ليشمل مواد نشطة بيولوجيا أخرى.

يمكن أيضا تعديله لحقن أنواع سمك السلور الأخرى أو أنواع الأسماك الأخرى التي لها بنية وتكوين البيض المتشابهة.