Name: 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 돼지 뇌 내피 세포를 이용한 생체 외 혈액-뇌 장벽 모델 수립 방법을. 높은 TEER와 낮은 투과성을 가진 이 모델은 약물 전달 및 수용체 이동 연구에 활용됩니다.

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저자 엘리자베스 헬레나 Bruun, 사라 크리스틴 크리스텐슨, 기술 지원, 닐스 M. Kristiansen를 인정 하 고 Lundbeck 재단 번호 R155-2013-14113를 부여.

저자는 충돌의 관심을 보고.

정화와 pBEC의 확산
정화 절차 동안에 중요 한 단계는 meninges의 신속 하 고 효과적인 제거 및 정화 수율 및 순도 대 한 모델의 적절 한 설립에 대 한 중요 하다 흰색과 회색 물질의 분리를 포함 합니다. 모델에 대 한 제시 생체 외에서 BBB pBECs를 사용 하 여, 우리 향상 있고 고립 된 회색 물질, 크기-선택적 microvessels, 콜라와 소화의 격리에 대 한 필터링의 기계적 균질에 따라 정화 절차를 간소화 DNase 및 트립 신, microvessel 조각의 초기 문화. 일반적으로 정화 및 1 차 셀의 주요 과제 중 하나는 오염 세포의 제거 이다. 경험과 기본 뇌 내 피 세포의 정화는 meninges 및 백색 질 결과의 철저 한 제거 순도 모세의 수율 개선으로 내 피 세포 성장 및 BBB의 표현을 증가 표시 하고있다 특성입니다. 이러한 이유로, meninges 제시 프로토콜에서 (sulci 안에 포함)의 제거 및 arteriolar 동맥 부드러운...

세포의 구조와 기능 혈액-뇌 장벽에의
순환 및 중앙 신경 시스템 (CNS)의 인터페이스에서 BBB 역할 CNS microenvironment의 homoeostatic 컨트롤에 대 한 주요 규제 사이트는 적절 한 기능과 신경 시스템의 보호를 위해 필수적 이다. BBB 사이트는 혈관 루멘을 일렬로 세우는 내 피 세포. 뇌 모세 혈관, 내 피 세포는 복잡 한 세포 꽉 접합 형성 하 고 특정 유입 및 경과 전송기의 강하게 편광된 식 패턴은 혈액과 뇌 1사이 높은 특정 분자 전송 보장. 단단한 접속점 복합물의 구조 구성 요소는 occludin 및 claudin, zonula occludens (ZO) 단백질, cingulin에서 단백질을 포함 하 고 접합 접착 분자 (잼) 관련. Claudin 5 paracellular 접합 제한에서 특히 중요 하다. Pericytes, 이다, 신경 및 뇌 내 피 함께 세포 형태는 지하실 막를 포함 하 여 주변 셀와 동적 상호 작용을 포함 하는 유도 및이 특성 BBB 내 피 형의 유지 보수는 혈관 단위 (NVU)2,3. 이러한 상호 작용에 관여 하는 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지 않습니다, 하지만 짧은 기간에 BBB 침투성의 변조를 허용 하 고 장기 BBB 기능4유도 세포 사이의 화학 신호 교환 포함. 이다 특히 뇌 내 피 세포 표현 형을 위해 알려져 있으며 glial 파생 된 neurotrophic 요인 (영향을 미치는 세포내 캠프)5,6기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 등 규제 요인의 원천 날린7, 그리고 변형 성장 인자 (TGF-β) β8. 그러나 TGF-β의 효과, 토론된9되었습니다.
생체 내에서 생체 외에서 BBB에서
Vivo에서 학문 계속 BBB 생물학에 유용한 정보를 제공 합니다. 그러나, 셀 문화 모델 추가적인 통찰력을 제공 하 고 건강 및 질병에 BBB의 상세한 분자와 기능적인 측면을 이해 하는 데 유용한 도구를 구성할 수 있습니다. 세포 유형 및 BBB의 성분 사이 복잡 한 상호 작용 생체 외에서 모델에 완벽 하 게 달성 하기 어려운 있지만, 거기는 이후, 뇌 내 피 세포의 첫 번째 정화 및 모노 문화에서 이러한 응용 프로그램 10 , 11 , 12, BBB의 성장 조건과 정화 절차의 광범위 한 개발 문화 모델, vivo에서 방 벽을 더 닮 았의 결과 세포. 일반적으로 사용 되 체 외에 BBB 모델은 기초를, 돼지, 설치류 및 소 출신의 1 차 셀에 불멸 하 게 세포에. 각 모델은 서로 다른 장점과 단점이 있다. 비교 및 모델 선택에 대 한 유효성 검사 마커 BBB 효소, 운송업 자, 수용 체, 그리고 구조 단백질의 표현 등은 현재 설립된 모델1의 개요를 만드는 데 사용 됩니다.
프로토콜의 목표
BBB의 중요 한 기능 중 하나는 배리어 견고 하 고 높은 TEER 아직 사용 가능한 모델의 많은 수를 반영 하지 않습니다 잘 비보에 수준. 이 프로토콜의 목표 BBB 모델 체 외에서 높은 TEER 기본과 기본 pBECs MC 또는 ACM, 없이 또는 NCC에 기반을 구축 하는 방법을 제시 하는 여러 실험실에서 개발 및 최적화 기여를 통합, 쥐 또는 돼지 근원의 이다입니다. 적용된 절차와 모델의 설립 포함 오염 세포를 제거 하 고 BBB 표현 형으로 pBECs의 차별화를 개선 하기 위해 노력 합니다. 이 작품은 낮은 paracellular 침투성 및 주요 꽉 접합, 전송기, 단백질과 수용 체의 기능 표현의 좋은 안정적이 고 높은 TEER 모델의 설립에 결과 있다. 그러나,는 이다 뇌 내 피 세포 표현 형을 기여 하는 요소는, 문화의 세 가지 다른 조건 뇌 내 피 세포의 3 개의 다른 고기를 나타냅니다. NCC 모델은 최대한 표현의 BBB 특징은 약물 발견, 전송 및 세포내 매매에 관련 된 특정 전문된 메커니즘의 연구 뿐만 아니라 세포 세포 상호 작용의 조사를 위해 특히 유용 유리.
기원과 프로토콜의 역사
여기에 설명 된 pBEC 모델은 기반 사이 실험실 (런던)에서 개발 된 돼지 모델 닥터 루이스 모건과 동료, whichis는 성공적인 이전 소 뇌 내 피 세포 모델13을 기반으로 합니다. 셀 준비의 원래 방법이 이었다 나일론을 사용 하 여 2 단계 여과 순도 개선 하기 위해 subculturing 단계 뒤 microvessels를 잡으려고 메시. 메서드의 이전 개발에 최적의 BBB 표현 형 및 압박감 ACM을 포함 하 여 보충된 매체에 성장에 의해 달성 했다. 메서드에 추가 수정 R. 스키 너에 의해 맨체스터 영국14,15명. 로스웰 교수 실험실에서 만들어졌다. 메서드는 Abbott 실험실, KCL 런던, Patabendige 크게 이다 또는 ACM의 사용을 피 함으로써 그리고 puromycin와 pericytes와 같은 오염 셀을 제거 하 여 준비를 간단 하 게 했다 그것은 의해 채택 되었다. 첫 번째 서류 MC 모델은 vivo에서 BBB, 효과적인 단단한 접속점, 수용 체-중재 transcytosis16,17 , 막 교통 시스템 등의 여러 가지 중요 한 기능을 유지 확인 , 18 , 19 , 20. 미 Yusof 나중 다시 사이토 공동 문화를 시험 하 고 그것은 크게 향상 된 TEER, 그래서 이것이 기본 variant 애 보트 연구소21에서 현재 사용 발견. 모델 지금은 성공적으로 되었습니다 M. 닐슨 전송 오르후스, 추가 수정 되었습니다 연구소 소개 (이 프로토콜), 단순화 그레이 포함 하 여 중요 한 메쉬 여과 단계와 단일 필터 코팅 단계를 사용 하 여 추출 콜라겐과 fibronectin 결합. 돼지 이다 (이 프로토콜)의 절연을 위한 적용된 절차는 센 외22에 의해 설명 된 알 보 그에서 토니 무스 연구소에 의해 개발 된 프로토콜에 근거 했다. 아후 스에서 생성 된 모델의 다른 속성과 TEER 비슷합니다는 자신감 개념 모델과 실험실 사이 전송 쉽게 잘 주의 관찰 및 합리화 방법 단계에 응답을 하 신 다. 실제로, S. Yusof 이제는 열 대 국가 (말레이시아)23, 현지 조건 및 조직 소스에 대 한 추가 조정 관련 MC 모델을 설립 했다.
이점을 다른 방법 및 현재 설립 모델
소와 설치류의 뇌 내 피 세포에 비해, pBECs는 vivo에서 BBB 형 절연24다음의 손실의 낮은 속도의 이점을 제공 합니다. 또한, pBECs bEND.5 및 bEND.3 (50 Ω c m2) 같은 셀 라인의 monolayers에 대 한 일반적으로 보고 된 수준에 비해 MC (800 Ω cm2)16 에서 재배 하는 경우에 상대적으로 꽉 내 피 방 벽을 형성 할 수 있다 25 , 26 , 27, ㄷ (300-800 Ω c m2)28,,2930및 cerebEND (500 Ω c m2)29,,3132, 그리고 기본 뇌 마우스 (100-300 Ω c m2)의 내 피 세포ss = "외부 참조" > 33,,3435,36 및 쥐 (100-300 Ω c m2)37,38. 그러나,는 TEER 정화 및 문화 절차에 의존성을 보이고 있다. 대부분의 경우, ACM의 추가 또는 이다 공동 문화 내 피 레이어1의 견고에 증가 내 피 세포에 차별화 효과 보여줍니다. 그럼에도 불구 하 고, 자란 조건 최적화에 노력, 소 기반 모델 나타났습니다 TEER 값 돼지 기반 모델 (평균 800 Ω cm2 MC, 사이토 공동 문화에 2500 Ω c m2 )에 비해13 ,39,40,41,,4243,44,45. 모델 기본 소 뇌를 기반으로 내 피 세포 사이 및 실험실14,45,,4647,48, 내 큰 변화가 나타났습니다. 재현성에 문제가 있을 수 있습니다. 여기 보고 pBEC 모델에서 기여 실험실 낮은 가변성, 실험실 사이 매우 비슷한 TEER 그리고 paracellular 침투성 값 달성 했다. 따라서, 그것은 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 낮은 변화 강력한 모델 확립에 다른 실험실에 대 한 가능 해야 합니다. 단단한 내 피 층을 형성, 뿐만 아니라 pBECs 모델 이전 검증 된 꽉 접합, 기능적인 BBB 전송기, 수용 체와 효소, 단백질과 연구15 의 범위에 대 한 시연된 적합성의 식에 의해 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. 또한, pBECs의 공동 문화에 게시 되지 않은 transcriptome 데이터 BBB 전송기와 수용 체 (미 발표 결과, 닐슨 그 외 여러분)의 예상된 프로필을 보여줍니다.
BBB 돼지-기반 모델에는 게놈, 해부학, 생리학, 더 이점이 있다 그리고 돼지의 질병 진행 반영 인간의 생물학60을 유리한는 기능에 대 한 다른 기존된 모델 보다 더 높은 학위에는 제약 산업입니다. 돼지 머리 고기 업계의 일반적인 부산물 이기 때문에, 그들은 두뇌의 쉽게 접근할 수 있는 소스는 실험에 필요한 한 돼지의 뇌에서 높은 정화 수확량을 제공 하는 동물의 수를 최소화 하는 내 피 세포 구성. 정화 및 1 차 셀의 다소 시간이 소요 되 고 표준화 모델 설정에 대 한 전문 지식이 필요로, 1 차 셀 가장 신뢰할 수 있는 BBB 모델을 생성 합니다. 불멸 하 게 셀 라인 수 없습니다 대신, 중요 한 속성으로 같은 수 장벽 압박감, 전송 식 프로필, 및 microenvironment 규칙 vivo에서실험 결과61, 를 반영 하지 않습니다. 62. 생체 외에서 모델 라이브 셀 높은 해상도 이미징, 목표를 사용 하 여 샘플링 또는 관찰 된 셀에 대 한 근접 접근 함으로써 세포내 프로세스의 시각화를 가능 하 게의 이점을 제공 높은 확대와 더 나은 광학 품질63. 이건 살아있는 동물에서 2 광자 현미경의 사용에 대 한 경우입니다. 또한, 생체 외에서 모델 transfect 세포, 태그 단백질의 시각화와 그들의 매매의 조사 하는 기능을 제공 합니다.
모델의 응용 프로그램
BBB의 기능 고정 되지 않습니다 하 고 동적으로 생리학과 병 리에 변조 될 수 있습니다. 신경를 포함 하 여 많은 신경 질환, 염증 성 및 전염 성 질병, 장애 및 BBB의 증가 된 침투성은 관찰64,,6566,67 . 감소 하 고 질병의 진행 및 후속 피해 방지, 식별 및 BBB의 변조를 기본 분자 메커니즘의 중요 한 중요성의 있습니다. 이러한 맥락에서 신뢰할 수 있는 생체 외에서 모델 높은 수요 제약 산업에에서 있는 고 BBB 침투성 CNS 약물의 예측에 중요 한 역할 게다가. 어떤 체 외 모델 침투성 화면으로 제한적인 paracellular 통로, 순수 현실 셀 건축과 기능 표현의 전송 메커니즘68표시 되어야 합니다. 이전 연구16,17,의57, 그리고 paracellular 침투성 및 여기 TJ 고에 단백질의 표정에 의해 입증, 제시 모델 이러한 모든 조건을 충족 하며 적합 BBB의 범위 두 정상 생리에서 및 병리학에서 연구입니다. 제시 정화 및 재배 방법의 강점 단순의 조합을 포함 하 고 재현성 및 astrocytic를 포함 하는 기능 결과 강력 하 고 신뢰할 수 있는 높은 TEER 생체 외에서 BBB 모델 영향. 이 대 한 목적, 돼지의 이다 고 쥐 원점 비슷한 방식으로22에 pBECs의 BBB 표현 형을 증가 시키기 위해 표시 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>론자</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/저혈당</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 유래 혈청(PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이</td><td>트 Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td> 96 % EtOH DNAse 1 Sigma-Aldrich<td>의 70 % 용액을 혼합합니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 CLS2</td><td>시그마 알드리치</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Elga 시스템</td></tr><tr><td>T75 플라스크로</td> 제작 <td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell 인서트 (세포 투과성 멤브레인 인서트)</td> <td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12-well 플레이트, 12mm 직경, 0.4 &mu; m 폴리카보네이트 멤브레인</td></tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원심분리기 튜브</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>크라이오 바이알</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500ml 병</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>유형 24</td></tr><tr><td>조직 균질화 기</td><td>시그마</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; m 필터</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 필터</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm 챔버 시스템</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12</td><td>EndOhm 챔버 12mm 배양 컵</td></tr><tr><td>EVOM2 전극 시스템</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>견고한 STX-100C 전극 쌍이 있는 TEER 측정 시스템</td></tr><tr><td>긴 바늘</td><td>시그마</td><td></td><td>주사기에 부착</td></tr> 미세한 <tr><td>팁 곡선 집게</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>넓은 팁 집게</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>필터 홀더</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 주사기</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin 항체</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 카테닌 항체</td><td>BD Transduction laboratories</td><td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-ZO-1 항체</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-Claudin 5 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Alexa Flour 568과 결합된 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Flour 488</td><td>과 결합된 당나귀 안티 마우스 IgGThermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>자당</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0.15&micro; l/ml 최종 작동 conc</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 &마이크로; g/ml 최종 작동 conc</td></tr></tbody></table>

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

이 프로토콜의 목적은 정화와 혈액-뇌 장벽 (BBB) 모델 체 외에 모노 문화 (MC), 사이토 조절 매체 (ACM), MC에에서 pBECs에 기반을 확립 하 고 pBECs의 재배에 대 한 최적화 절차를 제시 하 고 비 접촉 공동 문화 (NCC)의 돼지 이다 또는 쥐 근원. pBECs 절연 되었고 국내 돼지 5-6 개월의 뇌 외피가에서 모세 혈관의 조각에서 경작. 이 파편 meninges, 격리 및 회색 문제, 여과, 소화 효소, 그리고 원심 분리의 균질의 주의 제거에 의해 순화 되었다. 더 오염 세포 제거, 모 세관 조각 puromycin 포함와 경작 했다 매체. 60-95% 합칠, 모 세관 조각에서 성장 하는 pBECs를 passaged 했다 때 투과 할 멤브레인 필터 삽입 하 고 모델에 설립. 장벽 압박감 및 BBB 특성 표현 형 pBECs의 증가, 셀 다음 차별화 요인으로 취급 했다: 막 permeant 8-CPT-캠프 (여기 약식된 캠프), 하이드로 코 티 손, 그리고 포스 억제제, RO-20-1724 (RO)입니다. 절차 9 월 11 일의 기간 동안 실시 됐다 그리고 NCC 모델을 설정할 때는 이다 2-8 주 사전에 교양 있었다. 프로토콜에서 설명 된 절차를 준수 제한이 paracellular 침투성와 내 피 층의 설립을 허용 했다, NCC 1249 ± 80 Ω cm 는 평균 transendothelial 전기 저항 (TEER)를 보여주는 모델 2, 그리고 paracellular 침투성 (Papp) 루시퍼 노란색 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 cm 초-1 의 대 한 (± sem의 의미 n = 55). PBEC 표현 형이 더 평가 했다 5, 긴밀 접합 단백질 claudin의 좋은 표현 조-1, occludin 및 외화 접합 단백질 p120 catenin. 건강 및 질병에 BBB의 연구의 범위에 대 한 제시 하는 모델을 사용할 수 있습니다 그리고, 매우 제한적인 paracellular 침투성이이 모델은 전송 및 세포내 매매의 연구에 적합.

모델 체 외에 BBB의 설립
제시, 최적화 된 방법에서 pBECs의 재배와 설립 투과성 막 삽입 시스템의 MC 또는 ACM 또는 NCC 없이 이다 (그림 1)와 수행 되었다 9 월 11 일 (그림 2)의 동안. 내 피 세포의 선택을 위해, 순화 된 모 세관 파편의 초기 문화 puromycin 최대 5 일 대부분 오염 세포를 제거 하 고 승진에서 스핀 들 모양의 내 피 세포의 성장에 대 한 치료와 함께 결합 된 모 세관 파편 (그림 3A-C). 하루 4-6, pBECs는 접촉 저해, 경도 정렬 셀으로 겹치지 않는, 성장 60-95%의 confluency에 확산 했다....

프로토콜의 목표는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기반 모델 기본 돼지 뇌 내 피 세포 (pBECs)의 설립에 대 한 최적화 절차를 제시 하는입니다. 모델 쇼 높은 재현성, 높은 견고, 전송 및 세포내 매매 신약의 연구에 적합.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 긴밀한 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 설정하기 위해 일차 돼지 뇌 내피 세포를 정제하고 분리하는 것입니다. 이 방법은 약물 전달, 투과성, 수용체 이동, BB의 견고성 및 극성과 같은 혈액 뇌 장벽 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 모델의 주요 장점은 TEER이 높고 투과성이 낮은 체외 혈액-뇌 장벽 모델을 만드는 데 사용할 수 있는 1차 뇌 내피 세포의 높은 수율입니다. 이 절차를 시작하려면 뇌를 멸균 흐름 벤치에 놓고 얼음 위에 놓인 비커에 PBS 1리터로 부드럽게 씻습니다.다음으로, 가는 끝 집게를 사용하여 각 뇌에서 수막을 조심스럽게 제거합니다. 메스를 사용하여 뇌에서 회백질을 한 번에 하나씩 긁어내고 분리된 물질을 얼음 위에 놓인 DMEM/F-12 20밀리리터가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다. 초기 단편화를 위해 바늘 없이 50ml 주사기를 통해 회백질 물질을 실행합니다.모든 뇌에 대해 절차를 반복하고 수집된 회백질 물질을 함께 모읍니다. DMEM/F-12 배지를 사용하여 분리된 회백질 물질을 휴대용 조직 균질기의 분쇄기 튜브로 옮깁니다. 느슨한 유봉으로 8 번의 위아래 스트로크를 한 다음 단단한 유봉으로 8 번의 위아래 스트로크를 수행하여 재료를 균질화합니다.다음으로, 필터 홀더와 140미크론 필터 메쉬가 있는 500ml 파란색 캡 병을 사용하여 균질액을 여과하여 모세혈관을 분리합니다. 모세관 함유 필터를 소화 용액과 함께 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 180RPM으로 페트리 접시를 1시간 동안 배양하거나 10분마다 부드럽게 저어줍니다.1시간 후 페트리 접시의 현탁액으로 필터에서 모세혈관을 씻어냅니다. 그런 다음 3개의 접시에서 현탁액을 두 개의 50ml 튜브로 분리하고 각 50ml 튜브에 10ml의 DMEM/F-12를 추가하여 분해를 중지합니다. 세포 현탁액을 250배 g, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.그 후, 상등액을 흡인하고 각 펠릿을 10ml의 DMEM/F-12에 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브에 DMEM/F-12 20ml를 더 추가합니다. PBEC의 부착 조건을 최적화하려면 T-75 플라스크에 코팅 용액을 첨가하여 콜라겐 4가 밀리리터당 150마이크로그램, 피브로넥틴이 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 증류수로 만들어 용액이 전체 표면을 덮도록 합니다.다음으로, 섭씨 37도의 수조에서 모세혈관을 해동합니다. 동결 매체를 제거하려면 모세 혈관을 섭씨 4도, 250배 g에서 7분 동안 아래로 돌립니다. 그 후, 상층액을 조심스럽게 흡인하고 펠릿을 10 밀리리터 분취액 1-2 밀리리터에 재현탁시킵니다.그런 다음 모세관 현탁액을 코팅된 T-75 플라스크로 옮기고 플라스크를 부드럽게 기울여 표면에 균등하게 분포되도록 합니다. T-75 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정한다. 하룻밤 배양 후, T-75 플라스크 1개에 대해 밀리리터당 4마이크로그램의 퓨로마이신을 보충한 PBEC 성장 배지 10ml를 준비하고 배지 변경을 수행합니다.그런 다음 밀리리터당 500마이크로그램의 콜라겐 IV와 밀리리터당 100마이크로그램의 피브로넥틴으로 코팅하고 증류수로 PBEC 파종을 위한 투과성 멤브레인 인서트를 준비합니다. T-75 플라스크에 2ml의 트립신-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 트립신화하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5-7분 동안 놓습니다. 뇌 내피 세포를 분리하려면 T-75 플라스크의 측면을 손가락 끝으로 부드럽게 두드린다.그 후, 세포 용액을 15ml 튜브에 옮기고 250배 g, 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리하여 뇌 내피 세포를 스핀다운합니다. 그 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 1 밀리리터의 매체에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 2ml의 매체를 더 추가하여 총 부피를 3ml로 만듭니다.cell-counting chamber 또는 자동 cell-counting system을 사용하여 수동으로 세포 수를 계수합니다. 비접촉 공동 배양의 경우, 성상세포가 있는 웰로 삽입물을 옮기고, 전날 성상세포 성장 배지로 새로 고침을 받았습니다. 다음 날, PBEC가 포함된 투과성 멤브레인 인서트의 매체를 교체하십시오.그런 다음 웰에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 각 웰에 750마이크로리터의 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음 인서트에서 배지를 조심스럽게 흡입하고 인서트당 500마이크로리터의 분화 배지를 추가합니다. 그런 다음 나머지 750마이크로리터의 분화 배지를 각 성상세포 웰에 추가합니다.그 후, 다음날까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 분화 배지로 세포를 배양합니다. 분화 배지로 세포를 자극한 다음 날, 챔버를 이중 증류수로 2회, 70% 에탄올로 5분 동안 한 번, 이중 증류수로 두 번 더 헹구어 TEER 측정을 위한 조직 저항 측정 챔버 시스템을 준비합니다. 그런 다음 챔버를 시스템에 연결하고 조직 저항 측정 챔버에 DMEM/F-12 4ml를 첨가한 다음 약 30분 동안 실온에 둡니다.그런 다음 조직 저항 측정 챔버에 인서트를 조심스럽게 배치하여 TEER 측정을 수행합니다. 다음은 5일 동안 관찰한 PBEC, 배양 및 성상교세포의 위상차 현미경 이미지입니다. 초기 배양 첫날에 정제된 모세관 단편은 모세혈관과 오염 세포의 존재를 모두 보여주었으며, 2일차에 중간 변화를 보이고 추가 성장일째를 보낸 후 모세관 단편에서 성장을 시작하는 PBEC에 대한 선택을 보여주었습니다.PBEC의 합류 단층은 일반적으로 4일차에서 6일차에 달성되었으며, 이 때 PBEC는 방추 모양의 형태를 보였고 세로로 정렬되었습니다. 바닥 우물에 파종된 쥐 성상세포는 일반적으로 5일 이내에 합류층으로 증식했으며, 2주간의 성장 후 비접촉 공동 배양 모델에 사용되었습니다. 이 기술을 숙달하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 연구자들이 밀접하고 편광된 뇌 내피 세포에서 약물 전달 및 수용체 이동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 in vivo에서 수행할 수 없는 새로운 연구에 사용할 수 있는 in vitro 혈액-뇌 장벽 모델을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

이 비디오는 신선한 돼지 뇌에서 모세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 과정에는 수막을 제거하고, 뇌 조직에서 회백질을 분리하고, 모세혈관을 분리하기 위해 회백질을 균질화 및 여과하고, 마지막으로 효소 소화를 사용하여 모세혈관을 추가로 정화하는 작업이 포함됩니다.

돼지 뇌에서 모세혈관 정화

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)​​의 인체 모델의 확립 BBB 장애와 관련된 뇌 상태에 대한 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 우리는 여기서, 다공질 막의 양측에 인간 성상 세포와 뇌 내피 세포의 공동 배양을 허용 접촉 BBB 모델의 제조를위한 개선 된 기술을 설명한다.

방법 혈액 - 뇌 장벽의 인간 세포 기반의 연락 모델의 준비를 위해 개선

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

여기에서는 임피던스 세포 분광법을 사용하는 혈액-뇌 장벽의 체외 쥐 모델을 설명하며, 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향에 중점을 둡니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 임피던스 분광학을 사용하여 혈액 - 뇌 장벽 모델 : T 세포 - 내피 세포 상호 작용에 초점

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

혈액 뇌 장벽 (BBB) 단단히 뇌 항상성을 조절 하는 다세포 신경 혈관 단위. 인간 iPSCs와 오르간 온 칩 기술을 결합하여 질병 모델링 및 CNS 약물 침투성 예측에 적합한 맞춤형 BBB 칩을 생성했습니다. BBB 칩의 생성 및 작동에 대해 상세한 프로토콜이 설명된다.

인간 iPSC 기반 혈액-뇌 장벽 칩 생성

이 프로토콜은 인간 혈액-뇌 장벽(BBB) 시험관내 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 내피 세포와 혈관주위세포는 삽입 필터의 양쪽(혈액 구획)에 파종되고 성상세포는 하단 웰(뇌 구획)에 파종됩니다. 상기 모델 특성화는 나노입자 수송 실험에 사용되었다.

인간 혈액-뇌 장벽을 모델링하는 삼중 배양 세포 시스템

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

배우세요 돼지 뇌 내피 세포를 이용한 생체 외 혈액-뇌 장벽 모델 수립 방법을. 높은 TEER와 낮은 투과성을 가진 이 모델은 약물 전달 및 수용체 이동 연구에 활용됩니다.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

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