Name: プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶshRNAスクリーニング法でマウス腱線維芽細胞を用いてX染色体不活性化の調�因子を同定する方法。MeCP2レポーターと次世代シーケンスを組み合わせた遺伝学研究のプロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

優雅、スクリーンで使用される shRNA ライブラリを提供するメルボルン大学のロス ディキンズに感謝いたします。この作業によって、レット症候群の研究を信頼 (a. b.) 資金を供給されました。

動物を含むすべての手順は、フレッド ・ ハッチンソンがん研究センター機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されたプロトコルを使用して行われました。5-アザシチジン (5 字) を除いて重大な健康リスクを引き起こす知られていますここで使用する試薬はありません。
1. Xi にMeCP2- リュック ・ HR 遺伝子レポーター細胞ラインを生成します。
<ol><li>
MeCP2 リュック HR /X X 女性からマウス腱線維芽細胞を準備するMeCP2マウス
	<ol>
<li>10-12 日を安楽死させる-MeCP2 リュック HR/X X 古い女性MeCP2マウス。</li>
		<li>ストレート解剖はさみを使って、近位のテール部分の皮膚を環状切開を作る。</li>
		<li>尾の基盤の近くの死体を保持、尾の線維軟骨部分を公開するマウスから肌を引き出します。削除し、手術用のメスを使用して長いフラグメント 1 mm にターミナル公開される組織の 10 mm を切る。</li>
		<li>断片化された組織を 15 mL の円錐管含む 5 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1 U/mL ペニシリン、1 μ G/ml ストレプトマイシン、1.5 mg/mL コラゲナーゼ、転送済み 0.45 μ m とし、0.2 μ m のメッシュ フィルターでろ過します。連続回転で 37 ° C で 3-4 時間インキュベートします。</li>
		<li>10 分間遠心室温 500 x gでサンプルは 10 mL と 10% 牛胎児血清、1 U/mL ペニシリン 1 μ G/ml ストレプトマイシン (DMEM-10) 6 ウェル培養プレート上にプレート DMEM にペレットを再懸濁します。一度セルを通過し、次のステップに進む前に 10 cm のプレートを展開します。</li>
		<li>7を前述のように HPV 16 ウイルス遺伝子 (E6 ・ E7) を運ぶ表現のベクトルと、伝達を実行することによって、細胞を不死化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
単一細胞のクローンを選択してMeCP2記者式を評価
	<ol>
<li>10 cm のプレートから細胞を採取します。まず、メディアを吸引、0.05% トリプシン-EDTA の 1 つの mL を追加し、37 ° C で 2-5 分間インキュベートDMEM 10 9 mL で急冷し、15 mL の円錐管に再懸濁細胞を収集します。</li>
		<li>細胞を希釈と 1 セル/100 の最終的な集中に DMEM 10 μ L。 96 ウェルのプレートにして転送の懸濁液 100 μ l 分注を各ウェルに。</li>
		<li>井戸が合流、2-3 週を取ることができるまでは、37 ° C で孵化させなさい。すべての 3-5 日新鮮な DMEM 10 でメディアを置き換えます。合流、ウェルあたり 0.05% トリプシン-EDTA の 20 μ L で細胞を動員、96 ウェルのプレートの 2 つの重複したセットに分割します。</li>
		<li>ルシフェラーゼ活性アッセイ プレートの 1 つのセットを使用します。メディアの除去を必要としない均質なホタルのルシフェラーゼ アッセイ キットを使用します。キットに含まれているプロトコルに従ってください。</li>
		<li>1.2.4 のステップからの結果を使用して、プレートの残りのセットから検出可能なルシフェラーゼ反応のないクローンを選択します。24 ウェルとし 6 ウェル プレートにこれらのクローンを展開します。</li>
		<li>最高のルシフェラーゼ活性; クローンを同じように実行します。これは、検証のために肯定的な制御として使用されます。</li>
		<li>西部のしみのため 6 ウェル プレートの各ウェルの因数を収穫します。0.05% トリプシン-EDTA の 200 μ L で細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM-10、2 mL でクエンチし、セルの半分を 1.5 ml 遠心チューブに転送します。西部のしみのため溶解する前に PBS で 1 回洗浄します。あるいは、別の 6 ウェル プレートにセルの半分を転送します。セルはプレートの下に付ける、PBS で洗い、西部のしみのために分離します。</li>
		<li>西部劇を行うアンチ MeCP2 ルシフェラーゼ陽性細胞はアクティブ X 染色体; から野生型 MeCP2 を表現しないとルシフェラーゼ陰性細胞が表現を確認する抗体のしみ前に説明したプロトコル8に従ってください。肯定的な制御として脳組織、野生型マウスから溶解液を使用します。</li>
		<li>2 x 105 6 ウェル プレートで細胞/ウェルでいくつかの否定的なクローンをプレートします。10 μ M の 5 字で一度治療、72 時間インキュベートするメディアを変更することがなく、ルシフェラーゼ活性のアッセイの 1.2.3 のステップで説明したよう。</li>
		<li>5 字でルシフェラーゼ活性を獲得し、複数の 10 cm の板に拡大を開始する 1 つの否定的なクローン (Xi クローン) を選択します。液体窒素で残りの負のクローンをバックアップとして凍結します。肯定的なクローン (Xa クローン) を組織培養で維持またはさらに使用まで冷凍できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. スクリーニング hygromycin B 選択を使用して再活性化のためのライブラリ
<ol><li>
テスト クローンに感染する、選択を適用してシーケンスの DNA の収穫
	<ol>
<li>ShRNA ライブラリからヘアピンを表現するレトロ ウイルスの構造のウイルス濃縮を取得または目的のライブラリに含まれているプロトコルを使用して濃縮ウイルス上清を生成します。</li>
		<li>前の画面では、にライブラリ (使用可能な場合、GFP マーカーを使用して) 滴定しなさい。0.3 と 0.5 の間の感染症の多様性を目指してください。 注: は、偽陽性率を最小限に抑えるために、少なくとも 4 つの独立した画面を実行します。20 枚画面を使用して、ヘアピンの適切な表現を維持し、ランダム ドロップ アウト9を避けるのためのライブラリの 100 のカバレッジを取得します。しかし、下位のカバレッジが十分であること可能性が高い正の選択画面と大規模なライブラリのサイズを考えると、です。</li>
		<li>朝は、1 x 106 Xi 細胞培養プレート 10 cm をプレートします。</li>
		<li>午後は、新鮮な DMEM 10 5 10 μ G/ml polybrene のウイルス上清を含むメディアを置き換えることによってプレートに感染します。2.1.2 ステップで決定したウイルス上清の量を使用します。</li>
		<li>18-24 h 後メディアを吸引し、新鮮な DMEM 10 の 10 mL を各プレートに追加します。さらに 48 時間培養。</li>
		<li>朝は、0.05% トリプシン-EDTA プレートごとの 1 つの mL を使用して細胞を動員し、プレートごと DMEM 10 の 9 ml を癒やします。懸濁液を 100 μ m のメッシュ フィルターを実行します。フィルター処理された懸濁液を一緒にプール、種子 1 x 106セル/プレート 10 cm プレートの 2 セット。</li>
		<li>午後は、15 μ g/mL hygromycin B (0 日) を含む DMEM 10 で板の 1 セットのメディアを置き換えます。その他のセットで、メディアを新鮮な DMEM 10 だけに置き換えます。</li>
		<li>48 時間後に 0.05% トリプシン-EDTA の 1 ml を用いた平板の未処理のセットから細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM 10 の 9 ml を癒します。室温で 5 分間 15 ml の円錐管 500 × g で遠心分離し細胞を転送します。培養上清を吸引し、ペレットからの DNA の抽出をすぐに続行します。また、遠心分離のステップの前に大きなチューブに細胞をプールします。</li>
		<li>フェノールと chroroform の混合物を用いた DNA を抽出し、前述10としてナトリウム酢酸と冷エタノールと DNA の沈殿物します。個々 の事前選択 DNA サンプルをプールし、さらに使用するまで-20 ° C で保存します。</li>
		<li>Hygromycin B 選択 4 日間セットを培養を続けます。2 日後新鮮な DMEM 10 含む hygromycin B に選択メディアを補充します。</li>
		<li>7 日には、新鮮な DMEM 10 のみで選択メディアを置き換えます。2 〜 4 日間、回復を許可し、2.1.8 の手順で説明するようセルを収穫します。2.1.9 の手順で説明するよう、DNA の抽出を続行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヘアピン後の選択サンプルの濃縮を識別します。
	<ol>
<li>使用 5' コンテキスト (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') と 3' をループのプライマーを逆に (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') 事前と事後選択の DNA サンプルから半分ヘアピンを増幅します。抽出した DNA を別の PCR 反応反応ごとの DNA の 100-200 ng を使用すべて。 注: これらの 5' コンテキスト プライマーおよび 3' リバース ループ プライマー ミール 30 コンテキスト シーケンス shRNA 挿入の上流と shRNA ループ シーケンスにそれぞれ対応します。異なるライブラリは、異なる oligos を必要があります。必要に応じてサイズの異なる製品を分離精製工程を調整します。</li>
		<li>プライマーと DNA、削除し、100 と 200 の跪くの PCR の製品を回復使用サイズ選択ビーズ ビーズに含まれているプロトコルに従います。</li>
		<li>半分ヘアピンをシーケンスにシーケンス ライブラリを準備します。画面ごとの少なくとも 5000 万の読み取りを生成します。シーケンス キットおよび装置に適したプロトコルに従ってください。 注: 各 shRNA ライブラリ内の 1000-fold の表現との適切な表現を保証する、独立した感染 (各 shRNA を 100 形式で実施) の約 10 倍報道画面あたり 5000 万の読み取りを提供します各感染症のイベントです。</li>
		<li>完璧な試合でシーケンスをカウントする Perl スクリプトを使用して各 shRNA を列挙します。少なくとも 10 の読み取りは、さらなる分析のために予選プール Shrna を選んだ。予備選択後の比件数 1000 順列に基づいて虚偽の発見率 (FDR) の決定など、濃縮を計算します。Shrna の標的遺伝子を選んだ < 5% として FDR「ヒット」さらにテストするため。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 識別されたヘアピン (「ヒット」) を検証します。
<ol><li>
画面で識別される Shrna を含むパッケージ レンチ
	<ol>
<li>シード 8 x 106 293 FT 細胞あたり 10 cm のプレート上にプレート。</li>
		<li>9 ml の抗生物質無料 DMEM 10 プレートあたりのメディアを交換して次の日、トランスフェクション前にこの 30 分を行います。</li>
		<li>30 分間隔の間に transfection のため 2 つのミックスを準備します。<ol>
<li>ミックス 1 を準備 (プレート/shRNA; あたりスケール アップ Shrna の総数に従って): 最適な最小重要なメディアの 0.5 mL で 2 mg/mL ポリエチレンイミン (PEI) を 10 μ l 添加します。ピペッティングで混ぜるし、5 分間室温でインキュベートします。</li>
			<li>(ShRNA) あたりミックス 2 の準備: パッケージ化される shRNA ベクターの 4 μ g、VSV G 封筒ベクター (pMD2.G) の 1.5 μ g と 2.5 μ g 包装ベクトル (psPAX2) の最適な最小重要なメディアの 0.5 mL で混在します。 注: は、感染のネガティブ コントロールとして使用する包装で空レンチウイルスベクターを含みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ミックス 2 の各因数にミックス 1 の 0.5 mL を追加、軽くピペッティングで混ぜます。20 分間室温で暗闇の中で孵化させなさい。</li>
		<li>滴状形式でステップ 3.1.2 から各プレート上に混合物を適用します。ミックスに軽くプレートを旋回します。</li>
		<li>次の日は、5 ml の新鮮な DMEM 10 のメディアを置き換えます。</li>
		<li>初期のトランスフェクション後 48 時間は、上澄みを収集し、0.22 μ m フィルターを介してそれを実行します。前回復を最大限に DMEM 10 フィルターを濡れています。</li>
		<li>約数量 6 ウェル プレートによく感染するために理想的にフィルター処理された上澄み。</li>
		<li>-80 ° c 保存用試料を凍結またはすぐに伝達を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
伝達およびルシフェラーゼ レポーター再活性化と、Xi に野生型 MeCP2 遺伝子の再活性化のための個々 のヘアピンのテストします。
	<ol>
<li>朝は、1 × 105 Xi 6 ウェル プレートに細胞/ウェルをプレートします。</li>
		<li>午後は、2 ml の新鮮な DMEM 10 レンチ ウイルス上清および polybrene の 5-10 μ G/ml を含むメディアを置き換えることによってプレートに感染します。空レンチウイルスベクター由来ウイルス上清をよくコントロールに感染します。</li>
		<li>次の日は、DMEM 10 含む 1 mg/mL ピューロマイシン 2 mL でメディアを置き換えます。4 日間のカルチャです。</li>
		<li>新鮮な DMEM 10 の 2 mL でメディアを交換し、回復のための 48-72 時間を許可します。</li>
		<li>0.05% トリプシン-EDTA の 150 μ L で細胞を動員します。37 ° C で 2-5 分間インキュベートします。DMEM 10 1.5 mL で癒します。室温で 10 分間、15 ml の円錐管 500 × gで遠心分離し細胞を転送します。</li>
		<li>メディアを取り出し、ルシフェラーゼ アッセイ キットで提供される 100 μ L 換散バッファーに細胞を再懸濁します。室温で 5 分間インキュベートします。白 96 ウェル プレートとのキットに含まれているプロトコルを用いたルシフェラーゼ活性測定に lysates を転送します。肯定的な制御と感染陰性対照として空レンチウイルスベクター Xi 細胞 Xa セルを使用します。 注: 試金; 前に蛍光灯の光に白いプレートを公開することを避けるためこれは背景を削減し、アッセイの感度を上げます。アッセイ キットで提供されるプロトコル可能な限り暗闇の中で実行する場合に最も効果的であることがわかった。</li>
		<li>ヘアピンがアクティブな x 染色体に MeCP2 の発現レベルに影響を与えたかどうかを確認するのに tranduced Xi 細胞からの RNA を隔離し、量的な PCR を用いた野生型 MeCP2 (f: のみを増幅するプライマー MeCP2 の mRNA のレベルを測定5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3')。</li>
		<li>
オプション:細胞は、ピューロマイシンを選択から回復した後、最終濃度 0.2 μ M の 5 字を追加してアッセイの感度を高めます。メディアを交換しなくても 72 時間細胞の培養や、商業ルシフェラーゼ アッセイ キットを用いたルシフェラーゼ活性のアッセイします。</li>
		<li>沈黙の野生型 MeCP2 の再活性化を測定します。プロトコル手順 3.2.1 個々 のヘアピンを含むベクターを使用して、Xi に野生型 MeCP2 を抱く Xa 細胞に感染します。-3.2.4。細胞からの RNA を隔離し、量的な PCR を用いた野生型 MeCP2 のみを増幅するプライマー MeCP2 の mRNA のレベルを測定 (f: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', r: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3')。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+neurological+defects+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome.</a> Science. 315, 1143-1147 (2007).</li>
<li>Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+the+Puzzle+Pieces%3A+the+Bigger+Picture+of+XCI%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI.</a> Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).</li>
<li>Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+of+the+sex+chromosomes+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes.</a> Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+microglia+do+not+reverse+pathology+in+mouse+models+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome.</a> Nature. 521, E1-E4 (2015).</li>
<li>Sripathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screen+for+reactivation+of+MeCP2+on+the+inactive+X+chromosome+identifies+the+BMP%2FTGF-beta+superfamily+as+a+regulator+of+XIST+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).</li>
<li>Foster, S. A., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+type+16+E7+alleviates+a+proliferation+block+in+early+passage+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells.</a> Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160567">The Western Blot.</a> Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Strezoska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PCR+conditions+and+increased+shRNA+fold+representation+improve+reproducibility+of+pooled+shRNA+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.</a> PLoS One. 7, e42341(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High-Molecular-Weight+DNA+from+Mammalian+Tissues+Using+Proteinase+K+and+Phenol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).</li>
<li>Goto, Y., Takagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+embryos+rescue+embryonic+lethality+caused+by+an+additional+maternally+inherited+X+chromosome+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse.</a> Development. 125, 3353-3363 (1998).</li>
<li>Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+Xist+RNA%2C+DNA+methylation%2C+and+histone+hypoacetylation+in+maintaining+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation.</a> J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349, (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521, 232-236 (2015).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mbd1-Atf7ip-Setdb1+pathway+contributes+to+the+maintenance+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation.</a> Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+of+inactive+X+chromosome+reactivation+identifies+the+enhancement+of+DNA+demethylation+by+5-aza-2%27-dC+upon+inhibition+of+ribonucleotide+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).</li>
</ol>

博士・ レコは、フレッド ・ ハッチンソンがん研究センターの従業員としてこの記事に貢献しました。 見解は、彼自身と国立衛生研究所やアメリカ合衆国政府の見解を必ずしも表さない

私たちの最近の研究6ルシフェラーゼとマウス セルラインを生成、hygromycin 抵抗性遺伝子、Xi にMeCP2を融合し、ライブラリを導入 > 60,000 Shrna ターゲット > 25,000 の遺伝子。我々 有利さを見つけて 30 遺伝子がノックダウン授与生存 hygromycin B 選択で、 MeCP2と x 染色体のサイレンシングの制御における役割を示唆しています。これらの結果はあった個々 のヘアピンで報告されたセルラインを伝達とサイレント ルシフェラーゼ レポーターの再活性化の評価によって検証されました。
XISTを我々 の画面のすべての複製でトップ 4 つのヘアピンにターゲット発見には、嘲りながら11 XISTの極めて重要な役割を与えられた私たちのメソッドの強力な内部検証が用意されています。こうして私たちの方法12に対して追加の検証として、エピジェ...

1 つ女性、レット症候群、遺伝性精神障害の最も一般的なフォームMeCP2、正常な神経機能1に不可欠なタンパク質をエンコードする x 染色体遺伝子のヘテロ変異が原因です。MeCP2表現の復元だったように病1,のマウスモデルで神経学的な欠損を逆に、この疾患の治療への潜在的なアプローチは、Xi に野生型のMeCP2遺伝子の再活性化になります。2,4しますただし、メスの細胞における染色体 X 2 つのエピジェネティックなサイレンシングはしっかりと生物3,4の場合は、生涯維持と Xi 遺伝子の強力な再活性化の主要な必要があります。複数のエピジェネティックな調節経路で中断。
MeCP2のサイレンシングのメンテナンスに必要な要因を識別するために我々 は最初にMeCP2- ルシフェラーゼ - hygromycin 抵抗遺伝子融合 (MeCP2 リュック HR) を乗せて X 染色体 2 つのトランスジェニック マウス モデルを開発 (XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5。不安定で機能、(XMeCP2 リュック HR/Y) hemizygous 男性で模倣した表現型のMeCP2削除、レポーター遺伝子の表現の損失で起因したことが分かったMeCP2融合コンストラクトの表現が内因性 MeCP25の式と一致するパターンで容易に検出されました。非アクティブまたはアクティブのいずれかの x 染色体の構築と不死化線維芽細胞クローンを生成し、その元表現野生型 MeCP2 およびない記者の構築; 確認逆は、後者の本当だった。Xi (「レポーター細胞」) のレポーター細胞が作成を再アクティブ化することができることを示す生物発光アッセイの活動を得られる DNA 遺伝子サイレンシング廃止に知られているエージェントを demethylating 5-アザシチジン (5 字) に露出されたとき、したがって遺伝学的スクリーニングに使用されます。
次にMeCP2のサイレンシングのレギュレータのハイスループット遺伝学的スクリーニングを行った。記者のセルライン レトロ ウイルス ライブラリを含む感染した最初 > 60,000 異なる Shrna ターゲット >6マウスのゲノム5,の中の 25,000 の遺伝子 hygromycin B 選択を。ヘアピン周波数を事前に比較したし、次世代シーケンシングによる事後選択サンプル、記者として再活性化 hygromycin B 選択成長の優位性を与えられる責任のヘアピンの濃縮の結果します。このアプローチを使用して、我々 は 30 遺伝子サイレンシング、 MeCP2の関与し、個々 のヘアピンのレポーター細胞の伝達と、ルシフェラーゼ活性測定による調査結果を確認後。

<table><tbody><tr><td>293FT Cell Line</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>抗MECP2抗体</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96ウェル固体白色ポリスチレンマイクロプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV)</td><td>Open Biosystems</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library</td><td>Open Biosystems</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>イルミナ</td><td>SY&ndash;401&ndash;2501</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン</td><td>B Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>コロニースクリーニング用均質アッセイ</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>個々のヘアピン</td></tr><tr><td>を検査するための非均質アッセイルミノメーター TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>または類似のルミノメーター</td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v2</td><td>イルミナ</td><td>MS-102-2001</td><td>お使いの機器と互換性のあるキットを使用</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>VSV-G エンベロープベクトル</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンポリ</td><td>サイエンス</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td>パッケージング<td>ベクター</td></tr><tr><td>ピュロマイシン</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

プールされた shrna mecp2 再アクティブ化非アクティブ x 染色体上の画面

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

前方遺伝スクリーン、ヘテロクロマチンに挿入されたレポーター遺伝子を使用しては、モデル有機体のエピジェネティックな調節機構を調査するため広く使用されています。短いヘアピン Rna (Shrna) とクラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) などの技術は、二倍体の細胞でこのような画面を有効にしています。ここで説明の x 染色体の不活性化 (嘲りながら)、レギュレータの大規模 shRNA 画面マウス細胞株を用いたホタルのルシフェラーゼとメチル CpG 結合タンパク質の C 末端で hygromycin 抵抗性遺伝子ノックアウト 2 (MeCP2) 遺伝子非アクティブな x 染色体 (Xi)。レポーター細胞ラインの構造の再授与 hygromycin B 選択で、大きな shRNA ライブラリを選別し、ヘアピン、事後選択濃縮を使用して測定することによって、記者を再アクティブ化する私たちを有効に存続の利点次世代シーケンス。豊かなヘアピンが Xi のルシフェラーゼ レポーターを有効にする能力をテストすることによって個別に検証されます。

マウス腱線維芽細胞が収穫されたMeCP2 リュック HR/X X 上記からMeCP2雌マウス、HPV 16 virus7 から E6 と E7 遺伝子のレトロ ウイルスの伝達によって不死化制限の希釈を使用してクローンを作成およびテストルシフェラーゼ活性と野生型の MeCP2 タンパク質 (図 1 a および 1 b) の発現。ルシフェラーゼ活性は記者は、Xa、堅牢性と検出されない場合 Xi;ネイティブの MeCP2 表現は、相互のパターンを示した。ルシフェラーゼ活動 (Xi-8) クローンと堅牢な活動 (Xa-3) さらに実験のためにクローンを選びました。Xi 8 セルは 5 字と扱われた、ルシフェラーゼ活性の用量依存的誘導 (図 1) が見られました。
Xi-8 および Xa 3 細胞 hygromycin B への感受性は、3 と 6 日間にわたる選択を実行することによってテストされ...

小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X 染色体の遺伝子。

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、マウス腱線維芽細胞の調製から開始します。最初に培地を吸引することにより、10センチメートルのプレートから細胞を回収します。次に、0.05%トリプシンEDTAを1ミリリットル加え、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。インキュベーション後、9ミリリットルのDMEM-10でトリプシンをクエンチし、再懸濁した細胞を15ミリリットルの円錐管に集めます。DMEM-10で細胞を希釈し、100マイクロリットルあたり1細胞の最終濃度にします。次に、懸濁液100マイクロリットルを各ウェルにピペッティングすることにより、細胞を96ウェルプレートに移します。ウェルがコンフルエントになるまで、細胞を摂氏37度でインキュベートします(これには最大2〜3週間かかる場合があります)。メディアを新しいDMEM-10と3〜5日ごとに交換します。コンフルエントになったら、ウェルあたり20マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員し、それらを96ウェルプレートの2つの重複セットに分割します。1セットのプレートにおけるルシフェラーゼ活性のアッセイ。ルシフェラーゼアッセイキットに含まれているプロトコルに従って、培地の除去を必要としない均質なホタルルシフェラーゼアッセイを使用してください。アッセイ結果を使用して、残りのプレートセットから検出可能なルシフェラーゼ活性のないクローンを選択します。これらのクローンを最初に24ウェルプレートに拡大し、次に6ウェルプレートに拡大します。ルシフェラーゼ活性が最も高いクローンに対しても同じことを行います。これは、検証の目的でポジティブコントロールとして使用されます。6ウェルプレートで増殖させた後、ウェスタンブロットのために各ウェルのアリコートを回収します。200マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員します。細胞を摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。2ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチし、細胞の半分を別の6ウェルプレートに移します。細胞がプレートの底に付着するまで待ちます。次に、ウェスタンブロットの溶解前に細胞をPBSで一度洗浄します。6ウェルプレートにウェルあたり20万個の細胞でいくつかのネガティブクローンを播種します。細胞を10マイクロモルの5-アザシチジンで一度処理します。その後、培地を変更せずに72時間インキュベートしてから、以前と同様にルシフェラーゼ活性をアッセイします。次に、5-アザシチジンでルシフェラーゼ活性を獲得したネガティブクローンを1つ選んでスクリーニングし、それを複数の10cmプレートに拡大し始めます。残りのネガティブクローンをバックアップとして液体窒素で凍結します。ポジティブクローンは、組織培養中に保持することも、さらに使用するまで凍結することもできます。朝、100万個の不活性X細胞を10cmの組織培養プレートにプレートします。午後には、培地を、所定量のウイルス上清と1ミリリットルあたり5〜10マイクログラムのポリブレンを含む新鮮なDMEM-10に交換してプレートに感染させます。18〜24時間後、メディアを吸引し、各プレートに10ミリリットルの新鮮なDMEM-10を追加します。培養プレートをさらに48時間。午前中は、プレートあたり1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを使用して細胞を動員し、プレートあたり9ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチします。サスペンションを100ミクロンのメッシュフィルターに通します。ろ過した懸濁液を一緒に引っ張り、プレートあたり100万個の細胞で2セットの10センチメートルプレートを播種します。午後には、1セットのプレートのメディアを1ミリリットルあたり15マイクログラムのハイグロマイシンを含むDMEM-10と交換 B.In、もう1セットはメディアを新しいDMEM-10のみと交換します。48時間後、0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルを使用して、Hygromycin B未処理プレートから細胞を動員します。.摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。次に、9ミリリットルのDMEM-10で細胞を急冷します。個々のサンプルを採取し、すぐにDNAの抽出に進みます。ハイグロマイシンB選択セットをさらに6日間培養し続け、選択培地にハイグロマイシンBを含む新鮮なDMEM-10を隔日で補充します。6日目に、選択メディアを新しいDMEM-10のみと交換します。回復に4日間待ち、その後、選択後のサンプルDNAを以前と同様に回収します。選択後のサンプルで濃縮されたヘアピンの同定に進みます(テキストプロトコルに記載されているように)。ヒットを検証するには、まず、10 cm プレート上のプレートあたり 800 万個の 293 FT セルをシードします。翌日、切断の30分前に、プレートあたり9ミリリットルの抗生物質を含まないDMEM-10と培地を交換します。次に、トランスフェクションミックス2の各アリコートに0.5ミリリットルのトランスフェクションミックス1を加え、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、混合物を室温で20分間インキュベートします。混合物を各プレートに滴下するように塗布し、プレートを静かに回転させて混ぜます。翌日、最初のトランスフェクションから10.48時間後に培地を5ミリリットルの新鮮なDMEM-と交換し、レンチウイルス上清を回収し、DMEM-10で予め湿らせた0.22ミクロンのフィルターに通して回収を最大化します。翌朝、ウェルあたり10万個の不活性X細胞を6つのウェルプレートにプレートします。午後には、培地をレンチウイルス上清を含む2ミリリットルの新鮮なDMEM-10とポリブレン1ミリリットルあたり5〜10マイクログラムで置き換えてプレートに感染させます。空のレンチウイルスベクターから生成されたウイルス上清をコントロールウェルに感染させます。翌日、メディアをピューロマイシン1ミリリットルあたり1ミリグラムを含むDMEM-10の2ミリリットルと交換します。選択は4日間使用します。4日後、メディアを2ミリリットルの新鮮なDMEM-10と交換し、回復するまで48〜72時間待ちます。150マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで細胞を動員した後、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。1.5ミリリットルのDMEM-10で細胞をクエンチングした後、コニカルチューブに移し、室温でGの500倍で10分間遠心分離します。培地を取り出し、ルシフェラーゼアッセイキットに付属の100マイクロリットルの溶解緩衝液に細胞を再懸濁します。懸濁液を室温で5分間インキュベートします。5分後、懸濁液を白い96ウェルプレートに移します。暗室で、キットに含まれているプロトコルに従ってアッセイを実施します。活性X細胞をポジティブコントロールとして使用し、空のレンチウイルスベクターに感染した陰性X細胞をネガティブコントロールとして使用します。不死化マウス腱線維芽細胞クローンは、活性X染色体または不活性X染色体上のレポーターの配置とそれぞれ一致する、正または陰性のホタルルシフェラーゼ活性を示します。MeCP2発現は、ウェスタンブロットによって決定され、逆パターンを示します。ホタルルシフェラーゼ活性は、5-アザシチジンの投与によりネガティブクローンで誘導できることに注意してください。活性X染色体上に存在する場合、ハイグロマイシン耐性遺伝子は、不活性X染色体上に遺伝子を持つ細胞と比較した場合、ハイグロマイシン選択の下で生存上の優位性をもたらします。このビデオを見れば、不活性なX染色体に選択的に挿入されたレポーターを使用して、X染色体不活性化の調節因子のスクリーニングを設計し、実施する方法を十分に理解できるはずです。私の研究室では、以前に酵母のクロマチン調節因子のベーススクリーニングを実施しており、このアプローチの成功により、哺乳類細胞のX染色体不活性化の制御因子のためのこのスクリーニングを設計することになりました。この手順に続いて、哺乳動物細胞におけるX染色体の不活性化に関する追加の質問に答えるために、小さな干渉RNA、CRISPR、小分子を使用するなどの他の方法を実行することができます。

pooled-shrna-screen-for-reactivation-mecp2-on-inactive-x

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute...

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

南しみが付くことおよび/または PCR を用いたマウス胚性幹細胞に発生した相同組換えイベントを識別するための詳しいプロトコルを紹介します。このメソッドは、伝統的な胚性幹細胞を用いた相同組換えを介したターゲット技術を使用して非ミオシン II 遺伝子交換マウス...

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

ここでは、非ランダム X 染色体の不活化を伴う生存可能な雌マウスモデルを生成するためのプロトコルについて述べる、すなわち、母親-継承された X 染色体は、細胞の 100% で不活性である。我々はまた、インビボにおける不活性 X...

不活性 X 染色体上の Mecp2 の薬理学的再活性化のための非ランダムマウスモデル

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

エレクトロケミ発光免疫測定法(ECLIA)は、内因性および外因的に適用されたMeCP2タンパク質変異体の定量的検出のための新しいアプローチであり、幅広い作業範囲での低いイントラおよびインターアッセイ誤差で定量的、正確、再現性の高い測定を行います。ここでは、96 ウェル形式での MeCP2-ECLIA...

MeCP2タンパク質変異体に対するエレクトロケミセンスベースアッセイ

MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。...

工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶshRNAスクリーニング法でマウス腱線維芽細胞を用いてX染色体不活性化の調�因子を同定する方法。MeCP2レポーターと次世代シーケンスを組み合わせた遺伝学研究のプロトコルです。

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

さらに動画を探す