비 강 및 기관지 체액의 흡수: 인간의 호흡기 점 막 및 실험실 처리 샘플의 정밀 샘플링

오늘 우리는 점막 내막액을 흡수하기 위해 합성 흡수 매트릭스를 사용하는 정밀 점막 샘플링의 한 형태인 비흡수 기술을 시연할 것입니다. 비흡수 샘플러는 핸들과 멸균 극저온 튜브의 SAM으로 구성됩니다. SAM은 섬유 또는 발포체의 폴리머로 구성되며, 부드럽고 흡수성이 있으며 시료 채취를 위한 빠른 심지가 있도록 특별히 선택됩니다.

또한 SAM은 단백질 결합을 최소화하여 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있습니다. 비흡수는 아기를 포함한 모든 연령대의 환자에게 수행할 수 있는 매우 부드럽고 비침습적인 기술입니다. 또한 몇 분마다라도 직렬 샘플링이 가능합니다.

비흡수를 수행할 때는 먼저 손을 씻고 장갑을 착용해야 하며, 가급적이면 환자 앞에서 착용해야 합니다. 먼저 비강을 검사합니다. 헤드 토치를 사용하고 임상의가 주로 사용하지 않는 엄지손가락을 사용하여 환자의 코를 후퇴시켜 비강을 시각화하는 것이 좋습니다.

비강 검경은 일반적으로 필요하지 않습니다. 비강을 들여다보면 콧구멍이나 콧구멍은 단면이 둥글지 않고 똑바로 뒤로 뻗어 있습니다. 일반적으로 하부 비갑개는 콧구멍의 측면 벽에 움푹 들어간 돌출부로 보이며, 코 중격은 매끄럽고 평평한 내측 벽을 형성합니다.

우리는 이 하부 비갑개에서 표본을 추출하고 싶은데, 그 이유는 기저 상피가 호흡기의 단순한 섬모 상피이기 때문입니다. 샘플링할 때, 비강 흡수 SAM은 내강 위로 부드럽게 전달되어 하부 비갑개에 대해 평평하게 배치됩니다. 그런 다음 검지를 사용하여 SAM을 코 점막에 누릅니다.

이것은 MLF가 흡수될 때 눈물이 날 수 있는 약간의 간지러움을 유발할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 시간 제한 60초 흡수를 사용합니다. 그런 다음 비강 흡착 장치를 콧구멍에서 제거하고 냉동 튜브에 다시 넣고 즉시 얼음에 보관한 다음 급속 냉동할 수 있습니다.

또는 MLF를 즉시 용출할 수 있습니다. 비흡수는 다양한 코 점막 챌린지 모델과 다양한 기도 질환에서 연구되고 있습니다. 그러나 이 비교적 새로운 방법은 여전히 다른 호흡기 샘플링 방법에 대한 공식적인 검증이 필요합니다.

기관지 흡착 기술은 합성 흡수 매트릭스를 사용하여 기관지의 점막 내벽액을 샘플링합니다. 이 방법은 광섬유 기관지경을 통해 전문 인력이 수행합니다. 기관지 흡착 장치는 중앙 플라스틱 가이드와이어가 있는 외부 중공 카테터로 구성됩니다.

이것은 끝에 SAM이 있으며 핸드피스가 활성화될 때 압출될 수 있습니다. 비흡수와 마찬가지로 SAM 스트립은 부드럽고 흡수성이 있으며 시료 채취를 위한 빠른 흡수가 가능합니다. 또한 흡수된 분비물을 효율적으로 용출할 수 있도록 단백질 결합을 최소화합니다.

기관지 흡착 장치를 기관지 내시경에 놓기 전에 SAM이 카테터로 쉽게 돌출되고 다시 빠져나오는지 확인하는 것이 일반적입니다. 이제 기관지경 시뮬레이터를 사용한 기관지 흡착 방법을 시연하겠습니다. 먼저 표준 기관지 내시경 검사를 수행하여 기관지 내시경을 기관을 따라 오른쪽 주요 기관지로 들어가 오른쪽 하부 및 오른쪽 중간 엽의 구분에 바로 근접한 기관지 intermedius 수준으로

이 레벨에 삽입되면 5단계를 따릅니다. 하나는 카테터를 내리는 것입니다. 기관지경의 작동 채널을 통해 기관지경 끝에서 원위 최대 1cm까지 흰색 끝이 기도에서 보일 때까지 기관지흡착 카테터를 삽입합니다.

기관지경과 카테터 끝을 기도 내강 중앙에 두십시오. 점막 손상의 위험을 줄이기 위해 카테터 팁과 기관지 점막 사이의 접촉을 최소화하도록 주의하십시오. 둘, 샘 아웃.

기관지 흡착 장치의 손잡이를 눌러 SAM 스트립이 오른쪽 중간 또는 오른쪽 하엽 기도의 내강으로 돌출되도록 합니다. 직접 볼 수 있는 상태에서 기관지경의 끝을 구부려 SAM이 기도 벽의 점막 내막액과 접촉하고 있는지 확인합니다. SAM 스트립을 기도 내에 두고 30초 동안 점막벽에 평평하게 둡니다.

3점, SAM이 들어왔습니다. 직접 시력 하에서 SAM을 카테터로 직접 집어넣습니다. 집어넣을 때 촉촉한 SAM 프로브가 직선인지 확인하십시오.

필요한 경우 카테터와 기관지경 끝을 다시 가져와 SAM을 곧게 펼 수 있습니다. SAM을 집어넣는 데 어려움이 있는 경우 SAM이 기도 밖으로 돌출된 전체 장치를 빼냅니다. 넷, 카테터를 위로 올리세요.

기관지경의 작동 채널에서 전체 카테터를 빼냅니다. 다섯, 샘을 잘라버려. SAM은 멸균 가위로 잘라 냉동 튜브에 넣고 급속 냉동 또는 직접 용출하기 전에 즉시 얼음 위에 올려 놓아야 합니다.

다음 비디오 클립은 연구용 기관지 내시경 검사를 받는 환자의 기도로 SAM을 밀어내는 과정을 보여줍니다. 기관지 흡착은 현재 다양한 폐 질환에서 연구되고 있습니다. 우리는 이 정밀 점막 샘플링 방법이 진단 정밀 검사와 환자 계층화 및 모니터링에 유용하게 사용될 것으로 기대합니다.

비강 흡수 및 기관지 흡착 후 실험실 처리. The elution of Mucosal Lining Fluid from the Synthetic Absorptive Matrix(합성 흡수 기질에서 점막 내벽액의 용출). 오늘 우리는 비강 흡수 및 기관지 흡착의 비침습적 점막 샘플링 기술 이후 실험실 샘플 처리의 일반적인 원리를 시연할 것입니다.

특히, 합성 흡수 매트릭스에서 점막 내벽 유체 샘플을 용리하는 방법을 시연할 것입니다. 채취 시점에는 실험실로 운송하기 위해 샘플을 얼음 위에 올려 놓아야 합니다. 샘플은 즉시 처리하거나 나중에 용출하기 위해 원래 샘플 튜브의 급속 냉동에 직접 배치할 수 있습니다.

즉각적인 처리가 수행되는 경우 샘플을 얼음에 담아 원래 샘플 튜브에 넣어 실험실로 옮길 수 있습니다. 또는 SAM을 분리하여 채취 지점에서 용리 완충액에 넣은 다음 얼음에 담아 실험실로 옮길 수 있습니다. 샘플은 처리 전에 몇 시간 동안 버퍼에 넣거나 샘플 튜브 내에 얼음 위에 남아 있을 수 있습니다.

SAM의 원심분리 및 스핀 용출 전 세척 단계는 시료 수율을 최적화하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 SAM을 원하는 추출 버거와 함께 Eppendorf 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 샘플을 와류 믹서에서 30초 동안 혼합하여 느슨하게 부착된 유체와 생체 분자의 SAM을 세척합니다.

완전한 시료 회수를 보장하기 위해 세척에 사용되는 것과 동일한 Eppendorf tube 내부의 스핀 인서트에 촉촉한 SAM을 첨가하여 스핀 용리를 수행합니다. 이 절차에는 깨끗한 집게를 사용해야 하며 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 교체해야 합니다. 이 방법은 원심분리를 사용하여 SAM에서 유체를 추출합니다.

우리는 16, 섭씨 4도에 냉각된 원심분리기에 있는 000 g에 20 분 동안 표본을 원심분리기 한다. 사용되는 용리 버거는 원하는 응용 프로그램에 따라 결정됩니다. 우리는 일반적으로 단백질 함유 아미노 분석 완충액 또는 RNA 용해 완충액을 사용합니다.

두 가지 유형의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다. 첫 번째는 SAM을 제자리에 고정하는 플라스틱 메쉬만 포함하여 유체를 완전히 용출할 수 있습니다. 또는 감염성 물질로 작업하는 경우 0.2마이크로미터 기공 크기의 스핀 필터를 사용할 수 있습니다.

이 필터는 감염된 샘플의 오염을 제거하고 미생물 감염이 의심되는 샘플에 적합합니다. 이러한 필터가 필요한 경우 샘플을 추가하기 전에 proteinaceous buffer가 필터를 통해 흡수될 수 있는 사전 incubation 단계를 포함하는 것이 중요합니다. 이 단계는 비특이적 단백질 흡수에 의한 필터에 대한 매개체의 결합을 최소화합니다.

다음은 2급 병원체를 포함하여 오염 제거 단계가 필요하지 않은 샘플의 비흡수 및 기관지 흡착 처리를 위해 본 실험실에서 사용하는 방법의 예입니다. 1단계, SAM을 적절한 완충액과 와류가 들어있는 Eppendorf에 30초 동안 넣습니다. 비흡수의 경우 일반적으로 300마이크로리터의 완충액을 사용하고 기관지 흡착의 경우 100마이크로리터를 사용합니다.

2단계에서는 집게를 사용하여 SAM을 제거하고 SAM을 세척하는 데 사용되는 버퍼와 함께 플라스틱 메쉬 필터 컵에 넣습니다. 3단계: SAM이 들어 있는 플라스틱 메시 필터 컵을 원래 Eppendorf로 되돌립니다. 4단계, 필터 컵, 완충액 및 SAM이 포함된 Eppendorf를 섭씨 4도에서 16, 000g에서 20분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 SAM이 들어 있는 필터 컵을 제거하고 폐기합니다. 그런 다음 용리액을 분주하고 급속 냉동하여 나중에 분석할 수 있습니다. 비흡수 샘플링은 여러 임상 호흡기 연구 환경에 적용되었습니다.

여기에는 프로스타글란딘 D2 및 인터루킨 5와 같은 코 알레르기 유발 물질 중 염증 매개체의 측정이 포함됩니다. 이러한 챌린지 모델 설정에서 중요한 것은 비흡수에 의한 샘플링을 통해 매개체 수준의 빈번한 운동 프로파일링을 수행할 수 있으며, 여기서 샘플링은 몇 분마다 반복될 수 있다는 것입니다. 비흡수는 또한 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 리노바이러스 감염 챌린지 중에 사용되었으며, 연구 기간 동안 비흡수가 매일 반복되었습니다.

이 연구에서 비흡수를 사용하여 리노바이러스 감염에 대한 인터페론 반응의 민감한 특성을 규명할 수 있었습니다. 마지막으로, 비흡수 샘플링을 사용하여 세기관지염이 있는 영아를 연구했습니다. 이 연구에서 호흡기 세포융합 바이러스에 의한 감염은 인터페론 감마와 같은 염증 매개체의 수치가 더 높은 것과 관련이 있었습니다.

중요한 것은 비흡수를 이용한 샘플링을 통해 유아를 대상으로 한 연구에 건강한 대조군을 포함할 수 있다는 것입니다. 기관지 흡착은 건강한 피험자와 알레르기성 천식 환자를 대상으로 한 리노바이러스 챌린지 연구에도 사용되었습니다. 이 연구는 리노바이러스 감염 시 하부 기도에서 염증 매개체인 인터페론 감마, ITAC, IL-10 및 IL-5가 유의하게 증가했음을 보여주었습니다.

이 기술을 하기도 연구에 포함하면 기관지폐포 세척과 같은 기존 방법으로는 검출할 수 없는 매개체 수준을 측정할 수 있는 가능성이 생깁니다. 결론적으로, 점막 내막액은 비침습적으로 얻을 수 있으며 감염 및 염증에 대한 염증 반응을 측정할 수 있는 흥미로운 잠재력을 가지고 있습니다. 용리 방법은 샘플의 특성과 측정할 파라미터에 따라 조정해야 합니다.

특히, MLF는 점막 사이토카인 및 케모카인, 바이러스 감염, 바이러스 부하, 박테리아 및 진균 감염, 미생물 군집 및 점막 항체를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 점막 샘플링 및 용출 방법은 개별 프로젝트에 대한 맞춤형 개발과 신중한 검증이 필요합니다.