Name: Sovrapressione e purificazione delluomo Cis -preniltransferasi in (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Scopri come sovraesprimere e purificare la cis-preniltransferasi umana in Escherichia coli in condizioni non denaturanti. Questo metodo semplice e rapido consente di studiare la biosintesi degli isoprenoidi e le mutazioni legate alla retinite pigmentosa.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Centro per la Ricerca Eccellenza (I-CORE) della Fondazione Israel Science in Biologia Cellulare Strutturale (1775/12) e dalle sovvenzioni della Fondazione Israelica Science 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). Il supporto della Fondazione Fields Estate a DK è altamente apprezzato. Questo lavoro è stato eseguito da Ilan Edri e Michal Goldenberg in parziale adempimento dei requisiti di tesi MD della Facoltà di Medicina Sackler, Università di Tel Aviv.

1. Clonazione di cis -PT per sovraespressione in E. coli <ol><li> Ottenere pET-32b vettore di espressione, progettata per il clonaggio e di alto livello di espressione di sequenze di proteina fusa con la 109aa tioredossina (TRX) proteina 17, ed E. coli codone ottimizzato 18 sequenza codificante di intera lunghezza -PT cis. </li><li> Aver cura di avere un TEV-proteasi (tabacco virus etch proteasi) cleavage site (ENLYFQ / G, dove &quot;/&quot; indica il punto di scissione) 9 seguito da una breve linker flessibile (SGSGSG, che permettono di migliorare sito di scissione accessibilità) a monte dei cis -PT sequenza ( Figura 1 A ). Inoltre, aggiungere siti di restrizione 5 &#39;e 3&#39; per la clonazione. </li><li> Clonare il DNA costruito sintetizzato nel vettore pET-32b utilizzando tecniche standard di legatura 10 . </li></ol> 2. OverexpreSsion di DHDDS umani in E. coli <ol><li> Trasformare le cellule competenti di E. coli T7 con il TRD-fusion DHDDS conforme alle istruzioni del produttore. </li><li> Piattare le cellule trasformate secondo le istruzioni del produttore su LB-agar in condizioni selettive di ampicillina (200 mg / L). </li><li> Inoculare le colonie selezionate in 100 ml di mezzo LB in colture di avviamento a fiale di 250 ml con ampicillina da 100 mg / L e incubare per una notte a 37 ° C con scossa costante a 200 giri / min. </li><li> Inoculare 80 ml di coltura in due fiale da 5 L (40 ml per pallone), ognuno contenente 1,5 L di mezzo 2x YT (16 g / L di tryptone, 10 g / L di estratto di lievito, 5 g / L di NaCl) con 100 mg / L ampicillina. </li><li> Incubare la coltura a 37 ° C con scossa costante a 180 giri / min fino a raggiungere OD 600 nm = 0,5. </li><li> Abbassare la temperatura a 16 ° C e indurre le cellule aggiungendo 0.5 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG). controIncubare in condizioni uniformi per 16-20 h per l&#39;espressione proteica. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (10.000 x g per 10 min). Nota: il protocollo può essere interrotto qui; Le pellicole delle cellule devono essere mantenute a -80 ° C fino alla purificazione. </li></ol> 3. Purificazione di DHDDS umane <ol><li> Resuspendere le cellule nel tampone A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo), 1 μg / ml DNasi I e una miscela di inibitori della proteasi. </li><li> Homogenizzare le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro in teflon. </li><li> Distruggere le cellule utilizzando un microfluidizzatore o un equivalente a 12.000 - 15.000 psi 11 . </li><li> Centrifugare la lisi cellulare a 40.000 xg per 45 minuti a 4 ° C. Recuperare il surnatante, contenente la frazione solubile. </li><li> Caricare il supernatante su una colonna di cromatografia con affinità metallica immobilizzata di cobalto da 5-10 ml (Co 2+ -IMAC) 12 colonna con 10MM imidazolo, seguito da un lavaggio approfondito con tampone A e 10 mM imidazolo per ridurre la legame delle proteine ​​non specifiche. </li><li> Eluire le proteine ​​sovrapresse con tampone A integrato con 250 mM imidazolo. </li><li> Rimuovere l&#39;imidazolo usando una colonna di disintegrazione preparativa da 53 ml equilibrata con il tampone A. </li><li> Aggiungere proteasi TEV a 6xHis (1 mg TEV proteasi per 50 mg proteina) alle proteine ​​eluite per rimuovere la loro proteina di fusione TRX a 6xHis a 4 ° C per una notte. </li><li> Caricare le proteine ​​cedute su una colonna Co2 + -IMAC, equilibrata con un tampone A integrato con 5 mM imidazolo, per rimuovere la proteina fusione TRX tagliata a 6x His-contrassegnata e TEV proteasi. </li><li> Raccogliere il flusso e concentrarlo a 3 - 4 ml utilizzando un filtro centrifugo di taglio di peso molecolare di 30 kDa. </li><li> Caricare la proteina concentrata su una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni superdex-200 equilibrata con il tampone A per la purificazione finale. La proteina eluisce come dimero (~ 76 kDa). </li&gt; <li> Selezionare le frazioni rilevanti confrontando il profilo di eluizione con una curva di calibrazione della colonna. </li><li> Valutare la purezza del preparato usando SDS-PAGE. </li><li> Determinare la concentrazione proteica necessaria per la sperimentazione a valle e le aliquote di flash-freeze di proteine ​​purificate concentrate in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all&#39;uso. </li></ol> 4. Cromatografia analitica di esclusione di dimensioni (SEC) <ol><li> Per garantire la capacità della proteina di sopportare i cicli di congelamento e disgelo, scongelare una aliquota delle proteine ​​congelate e centrifugare a 21.000 x g per 10 minuti per rimuovere gli aggregati insolubili. Raccogliere il surnatante. </li><li> Caricare le proteine ​​su una colonna analitica superdex-200 pre-equilibrata con 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetanolo utilizzando un sistema di cromatografia liquida a ultrasuoni 13 , 14 . </li><li> Monitor di triptofano fluoro(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) per rilevare il profilo eluente di eluizione delle proteine. Assicurarsi di avere una curva di calibrazione valida per la valutazione del peso molecolare - tali curve sono disponibili tramite i produttori di colonna SEC. </li></ol> 5. Kinetica enzimatica - Attività dipendente dal tempo 15 , 16 , 17 <ol><li> Per garantire l&#39;attività della proteina purificata, mescolare 5 uM di DHDDS purificati con 10 FPP pM e 50 pM 14 C-IPP per iniziare la reazione in tampone A con 0,5 mM MgCl 2 a 22 - 30 ° C. Nota: le condizioni di reazione esatta possono variare con le preparazioni di cis -PTs diverse da DHDDS. Inoltre, l&#39;attività di DHDDS dipende anche dalla temperatura e da [Mg 2+ ]. Attenzione: 14 C-IPP è radioattivo e deve essere utilizzato in conformità alle normative locali in materia di sicurezza delle radiazioni. </li&gt; <li> Ritirare 15 μl di campioni dalla reazione a 0, 2, 4 e 6 h, dopo la tempra immediata della reazione mediante l&#39;aggiunta di 15 μl di tampone A integrato da 20 mM di EDTA (a una concentrazione finale di 10 mM EDTA). </li><li> Aggiungere 1 ml di 1-butanolo saturo di H 2 O e vorticarsi accuratamente per estrarre i prodotti di reazione. Nota: il protocollo può essere fermato qui e i campioni possono essere conservati per una lettura successiva. </li><li> Aggiungere un cocktail di scintillazione ai campioni e, utilizzando un contatore di scintillazione, quantitate i prodotti di reazione nella fase di butanolo che comprendono 14 C, insieme alla radioattività di 15 μL dalla miscela di reazione, rappresentando la radioattività totale. </li><li> Sottrarre le letture di fondo misurate utilizzando i campioni di 0 h da ogni punto temporale e calcolare il percentuale di 14 C-IPP utilizzati. </li><li> Calcola l&#39;incorporazione netta 14 di C-IPP ad ogni punto temporale calcolando il percentuale utilizzato dal totale 14 </Sup&gt; C-IPP, e tracciare i risultati in funzione del tempo. Si prevede un aumento della incorporazione netta 14 C-IPP con il tempo. </li></ol>

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<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
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<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il protocollo qui descritto per la purificazione di DHDDS umane funzionali nelle cellule E. coli è semplice ed efficace, permettendo uno di sovraespressione e purificazione della proteina in 3 - 4 giorni una volta che sia disponibile un opportuno costrutto. Tali protocolli per la purificazione della proteina sono di particolare importanza data le innovazioni nel sequenziamento genomico, che hanno fornito una grande quantità di informazioni riguardanti la genetica di molte malattie 18 , r...

Prenyltransferasi sono un gruppo di enzimi che catalizzano l&#39;allungamento della catena del difosfato allilico usando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple 1 , 2 . Gli enzimi di tipo Z catalizzano la formazione di doppie legami cis dalla reazione di condensazione, mentre gli enzimi E-tipo catalizzano la formazione di doppio legame trans 3 . Cis -Prenyltransferases ( cis -PT, Z-type enzymes) sono classificati in modo classico in base alla loro lunghezza della catena di prodotti in catena a catena corta (C 15 ), catena media (C 50-55 ) e catena lunga (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica che catalizza l&#39;allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosfato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Ciò si traduce nella formazione di deidrodolicilidifosfato, un polifenilcarbossilico di C 55-100 che serve come precursore per il dolichilpirofosfato, la molecola vettore del glicosilico coinvolto nella glicosilazione della proteina N-collegata 1 . Tra gli ebrei di Ashkenazi, una mutazione non-conservativa missense (K42E) in DHDDS produce una retinite pigmentosa autosomica recessiva 7 , 8 . Pertanto, il presente protocollo è stato sviluppato per acquisire DHDDS purificati idonei per studi meccanistici. Escherichia coli è considerato l&#39;host più conveniente e conveniente per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti, ed è pertanto anche l&#39;host più utilizzato. Tuttavia, quando si tenta di esercitare eterosamente le proteine ​​in E. coli , occorre fare considerazioni proteiche. Ottenere piegato correttamente, attivareE proteine ​​ricombinanti da E. coli , non è una materia semplice a causa delle proprietà distinte di diverse proteine. Numerosi approcci sono stati sviluppati per superare questi ostacoli. Qui, l&#39;uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l&#39;eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in E. coli . Da notare, un precedente tentativo di sovraespressione del lievito cis -PT senza fusione di proteine ​​non è riuscito a causa della completa insolubilità anche in presenza di detersivo 12 . Il protocollo descritto è semplice, conveniente, risparmio di tempo e consente di ottenere preparati DHDDS idonei per studi meccanici. Data l&#39;omologia del cis- PT tra diverse specie, suggeriamo che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express lysY&nbsp; Competente&nbsp; E. coli&nbsp; (Alta efficienza)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA Roche</td><td></td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Resina TALON-superflow</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 colonna di desalinizzazione</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>aumento del superdex-200 di 5/150</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-isopentenil pirofosfato</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>trans,trans-Farnesil pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

sovrapressione e purificazione dell'uomo cis -preniltransferasi in<emescherichia coli></emescherichia>

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferasi (PT) sono un gruppo di enzimi che catalizzano l&#39;allungamento della catena del difosfato alilico utilizzando isopentenil difosfato (IPP) attraverso reazioni di condensazione multiple. DHDDS (dehydrodolichyl difosfate synthase) è un cis -PT a lunga catena eucariotica (che forma cis doppie legame della reazione di condensazione) che catalizza l&#39;allungamento della catena di farnesil difosfato (FPP, un difosato allilico) attraverso condensazioni multiple con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS è di importanza biomedica, in quanto una mutazione non conservatrice (K42E) nell&#39;enzima provoca la retinite pigmentosa , portando alla fine alla cecità. Pertanto, questo protocollo è stato sviluppato per acquisire grandi quantità di DHDDS purificate, adatte a studi meccanici. Qui, l&#39;uso di fusione di proteine, condizioni di coltura ottimizzate e l&#39;ottimizzazione del codone sono stati utilizzati per consentire l&#39;eccessiva espressione e la purificazione di DHDDS umane attivamente attive in <em&gt; E. Coli. Il protocollo descritto è semplice, conveniente e risparmio di tempo. L&#39;omologia di cis- PT tra diverse specie suggerisce che questo protocollo possa essere applicato anche per altri cis -PT eucariotici, come quelli coinvolti nella sintesi di gomma naturale.

Panoramica generale del costrutto qui impiegato e del processo di purificazione sono mostrati in Figura 1 . I campioni ottenuti ad ogni passo di purificazione sono mostrati in Figura 2 . Questa analisi SDS-PAGE mostra la purificazione graduale di DHDDS, determinando un prodotto altamente purificato. La Figura 3 mostra i risultati della SEC analitica dell'enzima purificata, rivelando che la proteina ...

Un semplice protocollo di sovraespressione e di purificazione della cis -preniltransferasi umana ottimizzata dal codone, in condizioni non denaturanti, da Escherichia Coli , è stato descritto, insieme ad un test enzimatico di attività. Questo protocollo può essere generalizzato per la produzione di altre proteine ​​di cis- preniltransferasi in quantità e qualità adatte agli studi meccanici.

Sovrapressione e purificazione dell'uomo Cis -preniltransferasi in<emescherichia coli></emescherichia>

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sovraesprimere e purificare la cis-preniltransferasi umana ottimizzata per il codone in condizioni non denaturanti e di saggiarne l'attività enzimatica. La procedura è dimostrata con la cis-preniltransferasi eucariotica a catena lunga deidrodolidico difosfato sintasi, o DHDDS. Questo metodo può far progredire la nostra comprensione della sintesi degli isoprenoidi e fornire informazioni chiave sul meccanismo fisiopatologico della retinite pigmentosa correlata alle mutazioni in DHDDS.I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, economica e fa risparmiare tempo. Può anche essere generalizzato per la produzione di grandi quantità di altre proteine cis-preniltransferasi. Iniziare questa procedura con la clonazione di un'espressione di DHDDS umano, come descritto nel protocollo di testo.Risospendere le cellule nel tampone A, un microgrammo per millilitro di DNasi I e una miscela di inibitori della proteasi. Quindi, omogeneizzare le cellule risospese utilizzando un omogeneizzatore in teflon di vetro. Disgregare le cellule con un microfluidizzatore o equivalente a una velocità compresa tra 12.000 e 15.000 psi.Quindi, cen

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Immunologia e Infezioni

Questo protocollo di cinque giorni delinea tutte le fasi, attrezzature e software supplementare necessario per la creazione e l'esecuzione di un sistema di espressione TX-TL cell-free da zero efficiente Escherichia coli endogeno basato. Con i reagenti, il protocollo dura 8 ore o meno per impostare una reazione, raccogliere e elaborare i dati.

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Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

La co-espressione proteica è una potente alternativa alla ricostituzione in vitro di complessi proteici ed è di aiuto nell'esecuzione di test biochimici e genetici in vivo. Qui riportiamo l'uso della co-espressione proteica in Escherichia coli per ottenere complessi proteici e per regolare la frequenza di mutazione delle cellule.

I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

Efficiente Espressione cellulari di mammifero e Passo singolo Purificazione di extracellulare glicoproteine ​​per cristallizzazione

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Le analisi biochimiche e strutturali delle proteine glicosilate richiedono relativamente grandi quantità di campioni omogenei. Qui, presentiamo un efficiente metodo chimico per site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti purificate da batteri prendendo di mira i tioli reattivi di Cys.

Targeting dei tioli cisteina per in Vitro site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti

Biologia sintetica consente l'ingegneria delle proteine con proprietà senza precedenti tramite l'inserimento co-translational di aminoacidi non canonico. Qui, abbiamo presentato come una variante spettralmente rosso-spostato di un fluoroforo GFP-tipo con proprietà spettroscopiche di fluorescenza romanzo, chiamato proteina fluorescente "oro" (GdFP), viene prodotto in e. coli tramite incorporazione di pressione selettiva (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall'espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Questo articolo descrive una metodologia per sovraesprimere la Nsp15 ricombinante, una nucleasi tossica, in un sistema di espressione C41(DE3), seguita dalla purificazione della proteina marcata utilizzando la cromatografia di affinità e di esclusione dimensionale. Questi protocolli possono essere adattati per altre proteine tossiche impegnative.

Sovraespressione e purificazione di una nucleasi tossica da Escherichia coli

Scopri come sovraesprimere e purificare la cis-preniltransferasi umana in Escherichia coli in condizioni non denaturanti. Questo metodo semplice e rapido consente di studiare la biosintesi degli isoprenoidi e le mutazioni legate alla retinite pigmentosa.

Sovrapressione e purificazione dell'uomo Cis -preniltransferasi in

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