세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

이 전체 유선(whole mammary gland) 채취 기술의 전반적인 목표는 생체 외 온전한 분비선에서 유방 조직의 조직학적 표현을 쉽게 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 종양에서 기질 조직이 어떻게 리모델링되는지 또는 비정상적인 유전자 또는 단백질 발현이 유관 구조를 어떻게 변화시키는지와 같은 종양 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 건강하고 병든 쥐의 전체 유선에서 단백질 발현과 관 구조를 특성화하고 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Chris Thompson입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 8주에서 10주 된 암컷 무늬 쥐를 희생한 후 사체를 누운 자세로 고정하고 70% 에탄올을 사용하여 포화시킵니다. 집게를 사용하여 치골 바로 위의 가죽을 꼬집고 작은 수술용 가위로 긁습니다.

그런 다음 가위를 돌려 복부 정중선을 따라 가죽을 자르고 꼬리를 두개골로 이동합니다. 더 큰 가위나 지혈기를 사용하여 복막에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 피하 근막을 양측으로 둔탁하게 절개합니다. 절개 부위의 양쪽 말단 끝에서 수평 가장자리를 따라 자릅니다.

다음으로, 펠트 플랩을 핀으로 열고 조직에 PBS를 뿌려 촉촉하게 유지합니다. 그런 다음 관심 있는 유선의 위치를 파악하고 펠트 플랩 내부를 따라 메스 날을 밀어 유선과 관련 피하 지방을 진피에서 제거합니다. 서혜부에서 복부를 분리하기 전에 땀샘을 가능한 한 뚜렷하게 식별하도록 주의하십시오.

새로 분리된 분비샘을 약 6밀리리터의 10:1 용액을 들어 있는 원뿔형 튜브에 조직 부피 10% 중성 완충 포르말린에 즉시 담그고 24-48시간 동안 배양합니다. 슬라이드에서 파라핀을 녹이고 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이스를 다시 수화한 후 10밀리몰의 구연산나트륨 용액을 핫 플레이트나 전자레인지에서 끓여서 용액을 Coplin 항아리에 붓습니다. 슬라이드를 Coplin 용기에 천천히 넣고 완전히 잠기고 섭씨 100도에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 항원결정기를 회수합니다.

그런 다음 슬라이드를 제거하고 조심스럽게 말리십시오. 다음으로, 소수성 마커로 조직 주위에 장벽을 그립니다. 건조되면 PBS로 슬라이드를 1-2초 동안 헹굽니다.

그런 다음 조직을 덮을 만큼 충분한 내인성 효소 차단제를 추가하고 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 1X PBS에 10분 동안 담급니다. 그런 다음 조직을 덮을 만큼 10% 당나귀 혈청과 PBS를 충분히 첨가하고 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.

슬라이드에서 초과 차단제를 디캔팅하고 적절하게 희석된 1차 항체를 1% 혈청에 직접 추가하여 조직이 용액으로 고르게 덮이도록 합니다. 슬라이드를 실온의 가습 챔버에서 30분 동안 배양합니다. 조직 위로 약 1ml의 탈이온수를 흘러 슬라이드를 조심스럽게 세척한 다음 5분 동안 1X PBS를 한 번 교체하여 슬라이드를 배양합니다.

과량의 PBS를 디캔팅하고 양고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체를 충분히 첨가하고 가습된 챔버에서 샘플을 30분 동안 배양합니다. 조직 위로 약 1ml의 탈이온수를 흘러 슬라이드를 조심스럽게 세척하고 이전과 같이 5분 동안 1X PBS를 한 번 교체하여 조직을 배양합니다. DAB와 발색원 용액을 준비한 후 슬라이드에서 과도한 완충액을 디캔팅하고 발색원 염색 2-3방울을 조직에 직접 추가합니다.

가습된 챔버에서 샘플을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 조직 위로 약 1ml의 탈이온수를 흘러 슬라이드를 조심스럽게 씻습니다. 발색원 배양 후 최종 헹굼 후 슬라이드를 Harris hematoxylin에 2-2분 30초 동안 담그십시오.

그런 다음 1-2분 동안 수돗물로 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다. 슬라이드를 분화 용액에 2-3초 동안 담급니다. 그런 다음 약 1-2분 동안 수돗물로 슬라이드를 부드럽게 헹굽니다.

슬라이드를 파란색 에이전트에 60초 동안 담그십시오. 그런 다음 슬라이드를 95% 에탄올에 30초 동안 헹굽니다. 2-3분 동안 슬라이드를 알코올성 에오신 Y로 옮긴 후 각각 1분 동안 95%에탄올을 두 번 바꿔 조직을 탈수합니다.

그런 다음 마지막으로 100% 에탄올에 1분 동안 조직을 한 번 탈수합니다. 보푸라기가 없는 물티슈로 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오. 그런 다음 비수성 합성 수지 기반 장착 매체 한 방울을 슬라이드에 바르고 커버 슬립을 적용합니다.

덕트 분석을 수행하려면 알파 SMA에 대해 염색된 슬라이드를 선택합니다. 그런 다음 카메라에 장착된 대물렌즈가 장착된 광학 현미경을 사용하여 20X 배율로 대표 이미지를 수집합니다. 각 이미지의 덕트를 계산하려면 수동으로 계산하거나 ImageJ를 열고 플러그인을 선택합니다.

그런 다음 analyze(분석)를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 셀 카운터를 선택합니다. 초기화를 클릭한 다음 유형 1을 강조 표시하여 덕트 레이블 지정을 시작합니다. 완료되면 결과를 선택하여 덕트 수를 확인합니다.

선 도구를 사용하여 이미지의 축척 막대 위에 선을 그리는 것으로 시작합니다. 그런 다음 분석을 클릭하고 배율을 설정합니다. 다음 창에서 알려진 거리(known-distance)로 거리를 입력하고 길이 단위로 단위를 입력합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 측정 옵션 설정에서 영역과 둘레를 확인합니다. 그런 다음 자유형 다각형 도구를 사용하여 근상피 구획의 각 관 주위에 선을 그립니다.

측정을 선택하고 둘레와 면적을 기록합니다. freehand polygon 도구를 다시 사용하여 내강 내부 내에서 관 상피의 정점 쪽을 따라 선을 그립니다. 그런 다음 측정을 선택하고 둘레와 면적을 기록합니다.

근상피 구획 면적에서 내강 구획의 면적을 빼서 관 상피의 면적을 구합니다. 근상피 구획의 둘레에서 내강 구획의 둘레를 빼서 관 상피의 둘레를 구합니다. 면역조직화학 분석을 수행하려면 명시야 이미지를 ImageJ 또는 Fiji Suite와 같은 분석 소프트웨어에 업로드하십시오.

ImageJ의 플러그인 메뉴를 사용하여 IHC 도구 상자를 엽니다. 모델 선택 콤보 상자가 열리면 적절한 스테인을 선택합니다. 색상 옵션을 선택하여 얼룩을 격리합니다.

그러면 결과 창이 열립니다. 색상 선택기 슬라이드를 사용하여 배경 포함이나 과도한 얼룩 제거 없이 얼룩을 적절하게 격리하십시오. 이미지 유형(16비트)으로 이동하여 이미지를 16비트로 변환합니다.

그런 다음 image(이미지)로 이동하여 임계값을 조정하고 임계값을 조정하여 이미지를 임계값을 설정합니다. 마지막으로 분석으로 이동하여 결과 영역과 평균 회색 값을 측정하도록 측정값을 설정하고 분석, 측정을 선택하여 측정값을 수집합니다. 4번 유선의 이러한 고정된 부분에서 콜라겐, 피브로넥틴 및 테나신-C의 발현을 분석했습니다.

화살표는 이러한 조직에 관이 있음을 나타냅니다. 유관의 형태학적 특징을 정량화하기 위해서는 조직학적 절편을 주의해서 다루는 것이 중요한데, 부적절하게 취급하면 측정할 수 없는 조직과 유관이 손상될 수 있기 때문입니다. 분석에 사용할 수 없는 손상된 조직의 예가 여기에 나와 있습니다.

관을 측정할 수 있고 정량화할 수 있는 온전한 조직 표본이 이 패널에 표시되어 있습니다. 관은 주변의 피브로넥틴으로 염색된 기질뿐만 아니라 관의 내강을 감싸고 있는 상피 세포의 밀집된 집단에 의해 특징지어집니다. 이 피브로넥틴 염색 부분에서, 여러 온전한 관에는 화살표로 표시된 가지가 있습니다.

이 분석의 목적을 위해 이러한 관 분기는 별도의 관 구조로 간주되어서는 안 됩니다. 덕트를 평가하고 측정하는 동안 덕트와 혈관 구조를 구별하는 것이 중요합니다. 혈관 구조는 빨간색 화살표로 표시되고 관 구조는 검은색 화살표로 표시됩니다.

혈관 구조는 내강을 둘러싸고 있는 내피 단층의 존재뿐만 아니라 내강 내의 적혈구를 나타내는 핵, 호산구성 구조의 존재에 의해서도 식별될 수 있습니다. 일단 숙달되면 조직 채취는 동물 한 마리당 약 15분 안에 완료할 수 있으며, 단면 염색은 약 7-8시간 내에 완료할 수 있으며, 모든 것이 제대로 수행되면 다음 날 슬라이드 이미지를 촬영할 수 있습니다. 이러한 절차를 시도하는 동안 실험의 개별 목표에 따라 특정 단계에서 최적화가 필요할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 2차 고조파 생성 또는 코히어런트 안티 스톡스 라만 산란과 같은 다른 방법을 수행하여 조직 기질 구성 또는 구조에 관한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 종양 생물학과 같은 많은 분야의 연구자들이 인간 질병 및 병리학의 수많은 동물 모델에서 조직 조직 및 단백질 발현 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 유선을 해부하고 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한 카운터 염색제의 사용을 포함하여 조직 절편의 면역조직화학적 염색 절차를 이해해야 합니다. 동물과 동물의 조직 및 자일렌 및 DAB 발색체와 같은 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이러한 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 사육 교육 및 개인 보호 장비 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.