Toepassing van de Aorta-gonaden-mesonephros Explant cultuur System in Developmental Hematopoiesis
3 november 2017
Dit protocol beschrijving van het gebruik van gekweekte Aorta-gonaden-Mesonephros voor expressie analyses, kolonie-vormende eenheden in de cultuur en milt, en op lange termijn reconstitutie om te bepalen van het effect van regelgevende factoren en signaalroutes op hematopoietische stamcellen cel ontwikkeling. Dit is aangetoond als een doeltreffend systeem voor het bestuderen van hematopoietische stamcelbiologie en functie.
Het algemene doel van dit experiment is om een aorta-gonaad-mesonefrus explantaatcultuur te gebruiken om de cruciale regulatoren van de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen te onderzoeken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van HSC-biologie en functie over hoe de factoren die betrokken zijn bij de regulatie van HSC-ontwikkeling bij zoogdieren kunnen worden geïdentificeerd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze regulatoren kunnen worden geverifieerd door DNA-expressieanalyse en het vermogen tot kolonievorming en de reconstitutiecapaciteit van de HSC.
Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de nauwkeurige scheiding van AGM van de omliggende weefsels in de rompregio oefening vereist om te beheersen. Plaats voordat u met de procedure begint roestvrijstalen mazen in afzonderlijke putjes van een zes-putjesplaat met twee milliliter vers bereid fluoxetine-supplementmedium per putje. Plaats een UV-gesteriliseerde 0,65 microliter filter per experimentele put in een glazen celkweekschaal met vers kokend water voor twee drie-minuten wasbeurten, dompel de filters na elke wasbeurt gedurende twee minuten onder in een bak met PBS op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens een filter op elk stalen gaas op de lucht-vloeistofinterface van elke put. Gebruik vervolgens de dissectieschaart om de baarmoeder van een zwangere muis op embryonale dag 11 te strippen en verzamel de embryo's uit de baarmoeder. Gebruik dissectiescharen om de dooierzak, navelstreng en ingewanden van het embryo te verwijderen.
Verwijder vervolgens voorzichtig de dorsale zenuwweefsels en omliggende spierweefsels. Gebruik pincetten om de weefsels van de voorste en achterste ledematen te verwijderen. En scheid de AGM-regio van het embryolichaam.
Plaats vervolgens elke AGM op een enkele filter op de lucht-vloeistofinterface van elke put. Plaats de culturen in een incubator van 37 graden Celsius en 5% CO2. Na twee tot drie dagen brengt u de AGM-monsters over in afzonderlijke 1,5-milliliter microcentrifugebuisjes met 200 microliters collageenase voor hun dissociatie bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer 20 minuten met schudden om de vijf minuten.
Aan het einde van de spijsvertering stopt u de reacties met 200 microliter serum per explant. Breng de inhoud van elke buis over in afzonderlijke putjes van een 24-putjes ultralage aanhechtingsplaat met 500 tot 600 microliter M3434-medium per putje. Meng de cellen in elke put met een ene milliliter spuit zonder naald.
Plaats de plaat in de celkweekincubator. Het aantal kolonievormende eenheden in elke put kan vervolgens worden vastgesteld na zeven tot tien dagen kweken. Voor in vivo AGM explantaattransplantatie na twee tot drie dagen AGM-cultuur zoals net gedemonstreerd, bestraal acht tot 10 weken oude mannelijke C57 zwarte zes muizen dodelijk met negen grijzen straling.
Vier tot vijf uur later dissocieert u de geoogste explantaten in 200 microliter collageenase per monster zoals gedemonstreerd. Laad 0,5 tot één embryo-equivalent van de resulterende eencellissuspensies in een een-milliliterspuit per ontvangerdier. Plaats de eerste bestraalde muis in een begrenzer en veeg de staart af met een met 75% ethanol doordrenkte wattenstaafje om vasodilatatie van de staartader te bevorderen.
Injecteer intraveneus de inhoud van een spuit in een verwijde staartader. Gebruik een antiseptisch wattenstaafje om het bloeden te stoppen na het verwijderen van de naald. Breng het dier vervolgens terug in zijn kooi en injecteer het volgende dier.
11 dagen na de adoptieve overdracht kunnen de milten worden gefixeerd in Bouin's oplossing voor macroscopische enumeratie van de zichtbare miltkolonies. Fluoxetine-supplement AGM-culturen vertonen een verhoogde expressie van Runx1, een cruciaal gen voor HSC-ontwikkeling op het niveau van mRNA- en eiwitexpressie. Fluoxetine kan ook de kolonievormende capaciteit van HSC in de AGM significant verhogen, inclusief burst-vormende eenheid erytroïden, kolonievormende eenheid granulaire monocyten en kolonievormende eenheid granulocyten, erytrocyten, macrofagen en megakaryocyten.
Verdere in vivo transplantatie van fluoxetine-behandelde HSC geïsoleerd uit AGM-explantaten resulteert in een verhoogd aantal kolonies in de milten van bestraalde volwassen ontvangerdieren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de AGM te isoleren en een AGM explantaatcultuur uit te voeren voor de identificatie van de cruciale regulatoren van HSC-ontwikkeling binnen de AGM.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van gekweekte Aorta-Gonad-Mesonefros (AGM) voor expressieanalyses en colony-forming units om de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen (HSC) te bestuderen. Het is een effectief systeem voor het onderzoeken van de regulerende factoren en signaleringspaden die betrokken zijn bij de biologie van HSC's.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biologie van hematopoëtische stamcellen
- Celkweektechnieken
- Regulatoire factoren in de ontwikkeling
Achtergrond
- De AGM-regio is essentieel voor de ontwikkeling van HSC's bij zoogdieren.
- Inzicht in de regulatie van HSC's kan leiden tot vooruitgang in de regeneratieve geneeskunde.
- Kolonievormende assays zijn onmisbaar voor het beoordelen van de functionaliteit van HSC's.
- Het scheiden van de AGM van het omliggende weefsel vereist vaardigheid en oefening.
Doel van de studie
- Om kritische regulatoren van de HSC-ontwikkeling te onderzoeken.
- Om factoren te identificeren die betrokken zijn bij de HSC-regulatie.
- Om het begrip van de HSC-biologie en -functie te vergroten.
Gebruikte methoden
- Technieken voor AGM-explantaatkweek.
- DNA-expressieanalyse voor verificatie van regulatoire factoren.
- Kolonievormingsassays om het HSC-vermogen te beoordelen.
- Lange-termijn reconstitutiestudies.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van cruciale regulatoire factoren die de ontwikkeling van HSC beïnvloeden.
- Verificatie van factoren via DNA-expressieanalyse.
- Succesvolle demonstratie van het kolonievormend vermogen in gecultiveerde HSC.
- Inzichten in de signaleringsroutes die betrokken zijn bij de biologie van HSC.
Conclusies
- Het AGM-cultuursysteem is effectief voor het bestuderen van de ontwikkeling van HSC's.
- Inzicht in regulerende factoren kan therapeutische strategieën informeren.
- Deze methode biedt een platform voor toekomstig onderzoek naar hematopoiese.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het AGM-explantaatcultuursysteem pakt een belangrijk knelpunt in het onderzoek naar hematopoëtische stamcellen (HSC) aan door mechanistische studies mogelijk te maken zonder dat kiemlijn-knockoutmodellen vereist zijn. Deze benadering ondersteunt doelwitvalidatie en risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door farmacologische of genetische rescue-experimenten mogelijk te maken in een fysiologisch relevante embryonale niche. Het vergroot het voorspellend vertrouwen bij het identificeren van kritieke regulatoren van de HSC-ontwikkeling, wat bijdraagt aan portfoliobeslissingen binnen therapeutische gebieden die gericht zijn op hematopoëse.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de betrokkenheid van factoren bij de regulatie van HSC's te testen via rescue-experimenten in KO-achtergronden.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem om veranderingen in DNA-expressie en functionele outputs, zoals colony-vorming, te verifiëren, waardoor de afhankelijkheid van kostbare in vivo-modellen wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanische risicoreductie door moleculaire perturbaties te koppelen aan functionele HSC-outputs, zoals het reconstitutievermogen.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, multicellular readouts, waaronder CFU-E, CFU-GM en megakaryocytenkolonies, om de effecten van verbindingen op de differentiatie van HSC's te beoordelen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de functionele beoordeling van HSC's via colony-forming unit scoring na 7–10 dagen, waardoor de assay schaalbaar wordt voor verbindingsbibliotheken.
- Translationele waarde: Bereidt gevalideerde HSC-populaties voor op downstream transplantatiestudies, wat de brug slaat van discovery naar preklinische validatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Handhaaft de relevantie voor ziektebeelden door de embryonale hematopoëtische niche te behouden, waardoor de mechanismen van de ontwikkeling van mammale HSC's kunnen worden bestudeerd.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinisch werk door transplanteerbare HSC's te genereren met aangetoond reconstitutiepotentieel in bestraalde ontvangers.
- Risicobeperking: Maakt functionele validatie van targets mogelijk voorafgaand aan kostbare in vivo-studies, wat het vertrouwen in go/no-go-beslissingen verhoogt.
Integratie van pipeline en workflow
De AGM-explantaatkweek past binnen het ontdekkingscontinuüm van doelwitidentificatie via lead-optimalisatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor programma's op het gebied van hematopoëse en regeneratieve geneeskunde.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten van signaleringsroutes en transcriptionele regulatoren die de emergentie en expansie van HSC's beïnvloeden.
- Screening: Levert kwantitatieve, op fluorescentie of microscopie gebaseerde kolonie-outputs die dosis-responsanalyse en hit-bevestiging ondersteunen.
- Analytics: Maakt multiparametrische beoordeling mogelijk via mRNA/eiwitexpressie (bijv. Runx1), koloniemorfologie en in vivo repopulatie-eenheden.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met preklinische continuïteit door aangetoonde langetermijnreconstitutie in competitieve transplantatiemodellen.
- Enterprise Hergebruik: Dient als een herbruikbaar platform voor iteratieve targetvalidatie in meerdere projecten binnen therapeutische gebieden voor stamcellen en bloedziekten.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targets door moleculaire interventies te koppelen aan functionele HSC-fenotypes in een ontwikkelingsbiologisch accuraat systeem.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde protocollen voor explantaatisolatie, kweek en dissociatie, waardoor de variabiliteit in functionele assays wordt verminderd.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door risicoreductie van HSC-targets in een vroeg stadium mogelijk te maken, waardoor mislukkingen in een laat stadium door gebrek aan mechanisch inzicht worden geminimaliseerd.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering door functionele gegevens te leveren over de zelfvernieuwings- en differentiecapaciteit van HSC's voor de rangschikking van targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in embryonale dissectie en microsurgische technieken om de AGM-regio te isoleren zonder contaminatie van omliggende weefsels.
- Afhankelijk van een steriele celkweekinfrastructuur, inclusief CO2-incubators, low-attachment platen en steriele filtratie voor medium en reagentia.
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk voor de plaatsing van explantaten, de timing van de collagenasedigestie en de criteria voor koloniescore om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Aanpassing aan niet-murine modellen kan beperkt worden door soortspecifieke embryonale timing en weefseltoegankelijkheid, wat validatie in elk systeem vereist.
- Praktische beperkingen omvatten het smalle embryonale venster (E10.5–E11.5 bij muizen) voor AGM-isolatie, wat de doorvoer en planning in discovery-campagnes beïnvloedt.
