התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

פתוגנים הנישאים במזון תורמים לחלק גדול מבעיות בריאות הציבור בעולם, המשפיעות באופן משמעותי על שיעור התמותה והתחלואה האנושית. שיטות קונבנציונליות לאיתור פתוגנים הנישאים במזון דורשות טיפול מסובך בדגימות וגוזלות זמן. לאחרונה, חיישנים ביולוגיים הוכיחו את עצמם כשיטת זיהוי מבטיחה ומקיפה עם היתרונות של זיהוי מהיר ומעשיות.

פיתוח חיישנים ביולוגיים מבוסס על אלקטרודה מותאמת עם ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. אלקטרודת פחמן מודפסת על מסך שונתה כדי להגדיל את שטח הפנים הפעיל של האלקטרודה העובדת. למתילן כחול המשמש כקומפלקס חמצון חיזור יש קשר חזק עם DNA חד-גדילי של DNA בדיקה משותק.

קשר זה של אפיניות גבוהה מיוצג על ידי זרם שיא גבוה. הכלאה של DNA חד-גדילי עם הרצף המשלים שלו מחליפה את מולקולות המתילן הכחולות הקשורות, מה שמפחית את הזרם של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי. ייתכן שהסיבה לכך היא כמות קטנה יותר של מתילן כחול שנאספה על פני האלקטרודה שהשתנתה עם DNA דו-גדילי משלים, שנגרמה על ידי אינטראקציה בלתי ניתנת להשגה בין בסיסי גואנין.

צבע התמיסות המוכנות משתנה החל מצהוב לשחור ולבסוף לאדום אודם כהה. זה הצביע על כך שמלח הזהב הופחת על ידי יוני הציטראט. החומצה הפולילקטית המומסת עורבבה עם תמיסת ננו-חלקיקי הזהב שהוכנה קודם לכן ולאחר מכן ערבבה באופן הומוגני בטמפרטורת החדר, שסומנה לאחר מכן כננו-חלקיקי זהב מיוצבים של חומצה פולילקטית.

ספקטרוסקופיה גלויה אולטרה סגולה, עקיפה של קרני רנטגן, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה עם ספקטרומטריית קרני רנטגן מפזרת אנרגיה שימשו לאפיון ננו-חלקיקי הזהב המיוצבים בחומצה פולילקטית. כ-25 מיקרוליטר של התמיסה ההומוגנית של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית הוזרמו במהירות על המסך, אלקטרודת פחמן מודפסת ויובשו באוויר במשך 24 שעות לפני השימוש. האלקטרודות ששונו אופיינו לאחר מכן באופן אלקטרוכימי באשלגן פרוציאניד כדי למדוד שטח פנים פעיל, ספקטרוסקופיה של עכבה אלקטרוכימית, יכולת חזרה, שחזור ויציבות.

אופטימיזציה של מצב הקיבוע נקבעה באמצעות שלושה גורמים, ריכוז ה-DNA החד-גדילי נע בין 0.2 ל-1.4 מיקרומולר, זמן שנע בין 30 ל-220 דקות וטמפרטורה שנעה בין 25 ל-75 מעלות צלזיוס. מצד שני, אופטימיזציה של תנאי ההכלאה נקבעה באמצעות שני גורמים, שהם זמן שנע בין חמש ל-35 דקות וטמפרטורה שנעה בין 25 ל-75 מעלות צלזיוס. האלקטרודות ששונו שטופלו הוטבלו לאחר מכן ב-20 מתילן כחול מיקרו-מולרי למשך 30 דקות.

ה-DNA שלא נספג במיוחד ועודף מתילן כחול הוסרו על ידי שטיפה עם חוצץ אצטט מלוח pH 4.5 ולאחר מכן נשטפו במים נטולי יונים. זרם השיא של הפחתת מתילן כחול נמדד באמצעות טכניקת וולטמטריית דופק דיפרנציאלי. מדידת הוולטמטריה של הדופק הדיפרנציאלי בוצעה באמצעות pH מלוח מאגר פוספט 7.0 שלא הכיל אינדיקטור.

הליך דומה נערך עבור כל האינטראקציות. Vibrio parahaemolyticus כזני ייחוס ושמונה זני חיידקים אחרים, כלומר Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus ו-Vibrio alginolyticus של הפתוגן הנפוץ הנישא במזון שימשו לאימות חיישן הביולוגי של ה-DNA האלקטרוכימי במחקר זה. תת-תרבית שגרתית של זני חיידקים על האגר שלהם נערכה כל שבועיים כדי לשמור על חיותם.

כמות תאי Vibrio parahaemolyticus נקבעה בטכניקת צלחת מפוזרת. מילימטר אחד מתרבית תאי החיידק הועבר לתשעה מילימטר של מרק סויה טריפטיקאז המכיל 3% נתרן כלורי כדי לקבל מקדם דילול של 10. לאחר מכן, 0.1 מיליליטר מכל גורם דילול החל מגורם דילול חד פעמי של פי 10 עד פי 10 גורם דילול של 10 נמרח על צלחת של CHROMagar Vibrio לספירת מושבות, בהתאמה.

הקוקלים הושגו מהשוק הרטוב ולאחר מכן הובאו במהירות למעבדה בקופסת קירור קרח לניתוח. התרנגולים חולקו לשתי קבוצות, הקבוצה המטופלת והקבוצה הלא מטופלת, מתוך הנחה שהתרנגולים נקטפו באופן אחיד מתחילת המסיק ועד לאחסון בקירור בשוק. תרנגולים בקבוצה שטופלה טופלו מראש על ידי אחסונם במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן חשיפה לאור אולטרה סגול ב-20 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות לפני מיצוי ה-DNA.

טמפרטורת הקיפאון והחשיפה האולטרה-סגולה ששימשו לקבוצת הביקורת היו צפויים להרוג אותה או לפחות להגביל את הפתוגנים הנישאים במזון המצטברים באופן טבעי בקוקלים. משטר פסטור גבוה יותר של 70 מעלות צלזיוס לא יושם, מכיוון שמטרת המצב המבוקר במחקר זה הייתה לחקות את המצב האמיתי של הקוקלים הטריים. בינתיים, דגימות מהקבוצה הלא מטופלת נותחו ישירות ללא כל טיפול מקדים ברגע שהגיעו למעבדה.

הקוקלים נשטפו במים מזוקקים וקרצפו ללא לכלוך לפני הוצאת הרקמות מהקונכיות באמצעות מלקחיים סטריליים וארון זרימה למינר. כ-10 גרם דגימות רקמת קוקל הומוגניות עם ההומוגנייזר ב-19 מיליליטר של מרק סויה טריפטיקאז סטרילי המכיל 3% נתרן כלורי למשך 60 שניות. לאחר מכן נוספה כמות ידועה של פתוגנים הנישאים במזון לתשעה מילימטרים של מרק הדגימה ההומוגני עבור הדגימות הדוקרניות.

הדגימות הלא דוקרניות שימשו כביקורת שלילית. כמיליליטר אחד של דגימות הוזרמו לתוך שפופרת אפנדורף למיצוי דגימת DNA שתשמש לבדיקת החיישן הביולוגי ותגובת השרשרת של פולימראז. לאחר מכן חולץ ה-DNA הגנומי של הפתוגן הנישא במזון מהדגימות הדוקרניות והלא קוצניות.

DNA גנומי חולץ לאחר הליך ליזה מבושל שונה. הדנ"א הגנומי צנטריפוגה ב-12,000 סיבובים לדקה למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להשיג תרחיף ברור והסופרנטנט נשמר במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף. נעשה שימוש בביופוטומטר כדי לקבוע את הריכוז והטוהר של ה-DNA הגנומי שחולץ.

זהותם של כל הזנים נקבעה לאחר מכן באמצעות מבחנים ביוכימיים סטנדרטיים ואומתה על ידי ריצוף גנים של 16 SR RNA. לבסוף, הדנ"א הגנומי עבר דנטורציה ב-92 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות והתקרר במהירות במי קרח לפני יישום החיישן הביולוגי. אישור נוסף של פתוגנים הנישאים במזון נעשה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז המכוונת לגן המתאים.

המוצר המוגבר וגודלו נקבעו באמצעות אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז 1.5%. תמונות הג'ל צולמו באמצעות מערכת תיעוד ג'ל. הדור של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית אושר מהספקטרום הנראה האולטרה סגול, שצמיחת הפלזמה על פני השטח ושיא התהודה התבססה סביב 540 ננומטר.

היווצרותם וקיומם של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית צוינו בטווחי אורכי גל של 500 עד 600 ננומטר, תלוי בגודל החלקיקים. כל הפסגות הגבישיות של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית נצפו בשני הזירות ב-31.7, 38.2, 44.4, 64.7 ו-77.7 מעלות. עוצמות השיא של הגבישים גדלו גם כאשר שיאי עקיפה רחבים יותר נכנסו ב-31.7 מעלות, מה שמרמז על כך שהננו-חלקיקים הקרים היו משובצים בחומצה הפולילקטית ומרמז על היווצרות ננו-מבני זהב פוליפאזיים.

מעקומת התפלגות חלקיקי מיקרוסקופ אלקטרונים ותמונות של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית, ניתן היה לראות כי ננו-חלקיקי זהב הם כמעט כדוריים בצורתם. גודל הננו-חלקיקים היה בטווח של כ-37 ננומטר, שהוא מעט גדול יותר מזה שהתקבל מהנוסחה של שרר, מה שמרמז על אופי רב-גבישי של הננו-חלקיקים המסונתזים. הגודל העיקרי של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית חושב באמצעות משוואת שרר על ידי קביעת רוחב ההשתקפות של 100 בראג.

מהטבלה, גודל הגביש של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית חושב כ-27 ננומטר. מתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה ועם ספקטרום קרני רנטגן מפזר אנרגיה, לאלקטרודת הפחמן המודפסת במסך השונה היה אחוז המשקל הגבוה ביותר של זהב, הצפיפות הגדולה ביותר והמבנה הגדול ביותר של כיסוי ננו-חלקיקים. ספקטרום קרני הרנטגן המפזר אנרגיה אישר כי ננו-חלקיקי הזהב המיוצבים בחומצה פולילקטית כפי שנוצרו היו מורכבים מזהב בלבד ולא הציגו שום יסוד אחר מלבד השיא המתאים לפחמן וחמצן.

פוטנציאל השיא האנודי והקתודי היו עקביים בקצבי סריקה שונים, מה שמרמז על כך שהתגובה האלקטרוכימית הייתה הפיכה על סמך הפרדת שיא. שטח הפנים הפעיל של האלקטרודות ששונו חושב כ-0.26 סנטימטרים בריבוע ו-0.41 ס"מ בריבוע עבור האלקטרודה החשופה והאלקטרודה ששונה, בהתאמה. תוצאה זו אישרה כי השיפור שהעניקו ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית על שטח הפנים הפעיל היה גבוה יחסית בהשוואה לאלקטרודה החשופה.

ערך התנגדות העברת המטען עבור האלקטרודה החשופה היה 1, 932 אוהם, ואילו האלקטרודה שהשתנתה ירדה ל -1, 444 אוהם. הירידה בערך התנגדות העברת המטען באלקטרודה שהשתנתה עשויה לנבוע מירידה בקבוע הדיאלקטרי המקומי ו/או עלייה בעובי השכבה הכפולה החשמלית, מה שמרמז על כך שאשלגן פרוציאניד פעל על ידי ספיגה בממשק המתכת או התמיסה. זרמי השיא גדלו בהדרגה עם שינוי האלקטרודה החשופה באמצעות ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית, שהראו שרגישות גבוהה יותר היא ההיפוך של התנגדות העברת המטען הנמוכה יותר.

סטיית התקן היחסית של האלקטרודה שהשתנתה נגזרה כ-4.26% האלקטרודה עם שינוי ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית נתנה סטיית תקן יחסית טובה יותר לאחר מספר מדידות. ערכי סטיית תקן יחסיים של 4.05% עבור אלקטרודה שונה המצביעים על שחזור טוב יותר של ייצור האלקטרודה עבור ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית. הריכוז האופטימלי של ה-DNA היה 1.2 מיקרו-מולרי DNA חד-גדילי.

זמן הקיבוע האופטימלי של ה-DNA החד-גדילי נבחר כ-180 דקות. טמפרטורת הקיבוע האופטימלית של ה-DNA החד-גדילי נבחרה כ-55 מעלות צלזיוס. זמן ההכלאה האופטימלי של ה-DNA הדו-גדילי נבחר כ-10 דקות.

טמפרטורת ההכלאה האופטימלית של ה-DNA הדו-גדילי נבחרה כ-35 מעלות צלזיוס. DNA משלים הציג את זרם השיא הנמוך ביותר של 0.73 מיקרו-אמפר מבין ה-DNA שנבדק, DNA לא משלים, שלושה בסיסים DNA לא תואם ו-DNA לא תואם בסיס אחד. ברור שהזרם הגבוה מה-DNA שהותקף קטן יותר מהזרם של הרצפים האחרים של אוליגונוקלאוטיד.

תוצאה זו הצביעה על כך שניתן להשתמש בחיישן הביולוגי כדי להבחין ברגישות וספציפיות גבוהות. לחיישן הביולוגי של ה-DNA שנבנה הייתה סלקטיביות של זיהוי הכלאה באמצעות DNA בדיקה משותק על פני האלקטרודה ששונה. ירידה מתמשכת בזרם השיא של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי של מתילן כחול על האלקטרודה שהשתנתה הופעלה כתוצאה מעלייה בריכוז ה-DNA המשלים.

מתאם ליניארי בין הלוג של ריכוזי DNA יעד שונים 0.2 פיקומולר עד 0.02 מילימולר לבין הלוג של זרם שיא הפחתת מתילן כחול מתואר עם מקדם רגרסיה ליניארי של 0.96. אחוז ההתאוששות של חיישן ה-DNA הביולוגי המיוצר ירד לאט ללא פחות מ-80% מהאות הראשוני שלו לאחר שישה חודשי אחסון, מה שמצביע על כך שבדיקת ה-DNA החד-גדילי על פני האלקטרודה שהשתנתה יציבה ביותר. יציבות טובה לטווח ארוך בטמפרטורה מתחת ל-45 מעלות צלזיוס עשויה להיות הסיבה לתגובה החזקה בין ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית לבין DNA חד-גדילי.

תוצרי הגברת תגובת שרשרת הפולימראז עבור תשעה מינים שונים של חיידקים, שהיו Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae ו-Vibrio parahaemolyticus נבדקו. זרם השיא של וולטמטריית הדופק הדיפרנציאלי המתקבל לאחר הערכת תגובתיות צולבת מראה זיהוי ברור מאוד של Vibrio parahaemolyticus בהשוואה למיני חיידקים אחרים. ניתן לראות זאת על ידי הפחתת מספר זוגות הבסיסים, אות הוולטמטריה של הדופק הדיפרנציאלי הנצפה עולה.

זה קשור לכמות הגדולה יותר של מולקולות מתילן כחולות עד לבדיקות. מניתוח תגובת השרשרת של פולימראז, Vibrio parahaemolyticus נמצא הן בדגימות המטופלות והן בדגימות הלא מטופלות, כפי שמוצג על ידי נתיב 7, 8, 9, 10, 11 ו-12. ואילו הדגימות הלא דוקרניות שטופלו ולא טופלו בנתיב 1, 2, 3, 4, 5 ו-6 היו נטולות Vibrio parahaemolyticus.

תוצאות הזיהוי מתבצעות באמצעות חיישן ה-DNA הביולוגי שפותח אשר קבע בהצלחה את נוכחותו של Vibrio parahaemolyticus בקבוצה המטופלת המורכבת מדגימות דוקרניות ולא קוצניות. תוצאות אלה מתואמות באופן חיובי עם תוצאות תגובת שרשרת הפולימראז שנדונו קודם לכן. ליישום של ננו-חלקיקי זהב מיוצבים בחומצה פולילקטית יש פוטנציאל גדול ליישום כשינוי לתחושת ייצור נוספת.

ניתן להשיג סלקטיביות גבוהה כאשר קומפלקס החיזור נקשר חזק יותר למולקולת הזיהוי הביולוגי הלא היברידית, מה שעשוי להיות חידוש שכדאי לעקוב אחריו.