Intero Genome Sequencing di glabrata del Candida per rilevazione di marcatori di antifungini farmaco resistenza

L'obiettivo generale di questo studio è implementare il sequenziamento dell'intero genoma per l'identificazione di mutazioni nei geni che conferiscono resistenza ai farmaci antifungini nella Candida glabrata in un laboratorio diagnostico. Il sequenziamento dell'intero genoma dei funghi può dare un contributo significativo nel campo della resistenza ai farmaci antifungini. Consente il rilevamento simultaneo di mutazioni dell'intero genoma in funghi resistenti ai farmaci a importanti agenti antifungini.

Il sequenziamento dell'intero genoma di funghi importanti dal punto di vista medico può anche consentire il rilevamento e il monitoraggio di focolai, malattie fungine ed eventi di trasmissione in ambito sanitario, nonché l'emergere di specie fungine e cloni che i medici dovrebbero conoscere. A dimostrare questa procedura saranno la dott.ssa Rebecca Rockett e la dott.ssa Verlaine Timms, entrambe ricercatrici di dottorato del nostro laboratorio. Per iniziare, prepara campioni di DNA genomico da ceppi clinici e commerciali di Candida glabrata.

Quindi aggiungere cinque microlitri di DNA quantificato a ciascun pozzetto di piastra a parete sottile a guscio duro a 96 pozzetti precedentemente etichettata. Aggiungere 10 microlitri di tampone di tagmentazione e cinque microlitri di tampone di amplificazione a ciascun pozzetto. Quindi utilizzare una pipetta per miscelare delicatamente i campioni e sigillare la piastra con un sigillo adesivo, inserire la piastra all'interno di un termociclatore ed eseguire il programma PCR appropriato.

Quando il campione ha raggiunto i 10 gradi Celsius, aggiungere immediatamente cinque microlitri di tampone di neutralizzazione e utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente i campioni. Quindi sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo il periodo di incubazione, aggiungere 15 microlitri di Indexing PCR Master Mix a ciascun pozzetto.

Disporre gli strumenti di innesco in una rastrelliera per piastre di indice e annotare la posizione degli indici sulla dima. Quindi posizionare la piastra di tagmentazione contenente PCR Master Mix sul rack della piastra di indicizzazione con le provette di indice nell'ordine corretto. È importante disporre l'innesco indice in un tubo con orientamento orizzontale e l'innesco indice due tubi in orientamento verticale.

Si basa sull'ordine e sulla posizione forniti nel modello di indice. Rimuovere i vecchi cappucci dai tubi di innesco indice e gettarli. Con una pipetta multicanale, aggiungere cinque microlitri di primer indice a ciascun pozzetto.

È importante eseguire questa fase con attenzione per evitare la contaminazione incrociata tra campioni e indici. Per evitare la contaminazione incrociata tra gli indici, sostituire ciascuno dei vecchi cappucci dei tubi indice. Infine, sigillare la piastra ed eseguire il secondo programma PCR.

Per prima cosa trasferire il prodotto PCR dalla piastra di tagmentazione a una piastra a pozzetti profondi. Agitare una soluzione di microsfere magnetiche e aggiungere 30 microlitri di perline a ciascun pozzetto. Quindi agitare la piastra su un agitatore per micropiastre e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Posizionare la piastra su un supporto magnetico per due minuti o fino a quando il surnatante non è limpido. Quindi, senza spostare la piastra, scartare con cura il surnatante e aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80%. Con la piastra ancora sul supporto magnetico, incubare per 30 secondi prima di scartare il surnatante.

Ripetere il processo di lavaggio e lasciare asciugare le perline per 15 minuti. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 microlitri di tampone di risospensione alle perline. Utilizzando uno shaker per micropiastre, agitare la piastra per due minuti a 1.800 giri/min.

Quindi, dopo che l'agitatore si è fermato, incubare la piastra a temperatura ambiente per due minuti. Al termine del periodo di incubazione, posizionare la piastra su un supporto magnetico fino a quando il surnatante non è limpido. Infine, utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 50 microlitri di surnatante trasparente dal vassoio di pulizia a una piastra rigida fresca.

Per prima cosa, seguire i reagenti di normalizzazione della libreria e trasferire 20 microlitri di surnatante chiaro dalla piastra a guscio rigido a una nuova piastra a pozzetti profondi. Aggiungere 45 microlitri di una sospensione di microsfere magnetiche a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi e utilizzare un sigillante per piastre per sigillare la piastra. Quindi, agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1.800 giri/min per 30 minuti.

Posizionare la piastra su un supporto magnetico per due minuti fino a quando il surnatante non si è liberato. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante e smaltire il surnatante in un contenitore per rifiuti pericolosi appropriato. Quindi rimuovere la piastra dal supporto magnetico e utilizzare 45 microlitri di tampone di lavaggio per lavare le perline.

Agitare la piastra su uno shaker per micropiastre e posizionare la piastra su un supporto magnetico per due minuti. Dopo che il surnatante si è cancellato, gettare il surnatante e rimuovere la piastra dal supporto magnetico. Ripetere nuovamente il processo di lavaggio con il tampone di lavaggio.

Prima di rimuovere la piastra dal supporto magnetico, aggiungere NaOH a ciascun pozzetto. Quindi agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1.800 giri/min per cinque minuti prima di posizionare la piastra su un supporto magnetico fino a quando il liquido non è limpido. Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione a ciascun pozzetto di una nuova piastra a parete sottile a guscio rigido a 96 pozzetti.

Infine, trasferire 30 microlitri di surnatante dalla piastra di normalizzazione a ciascuno dei pozzetti contenenti il tampone di eluizione. Ora, la piastra di libreria normalizzata finale è pronta per essere sequenziata in ulteriori esperimenti. Sono stati studiati 13 isolati di C.glabrata ottenuti prima e dopo la terapia antifungina composta da C.glabrata ATCC 90030 e dodici isolati da un laboratorio clinico.

La concentrazione inibitoria minima, o MIC, è stata ottenuta per ciascun isolato per nove agenti antifungini. Questa tabella elenca i valori MIC per ciascuna condizione di test antimicotico isolato. La presenza di SNP nei geni che conferiscono resistenza nell'isolato è correlata con un'elevata MIC in vitro contro i farmaci antifungini.

Questa tabella riassume le posizioni degli SNP negli isolati clinici di C. glabrata e i farmaci a cui i geni conferiscono resistenza. Dopo aver visto questo video, gli spettatori possono replicare questa tecnica in un laboratorio diagnostico per l'accreditamento nel sequenziamento dell'intero genoma. Evidenzia le fasi importanti della preparazione della libreria di DNA e i punti essenziali di controllo della qualità per ottenere risultati accurati e riproducibili.