Name: 두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 학습하세요 두뇌 조각에서 전체세포 패치클램프 기록과 2광자 칼슘 이미징을 결합하여 수상돌기의 칼슘 역학을 고해상도로 관찰하는 방법을. 이 기술은 시냅스 통합 과정과 신경 가소성 연구에 필수적입니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 발견 부여)와 사 보이 재단에 의해 지원 되었다. OC에서 NSERC 박사 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 실험 동물 보호 위원회 대학교 발 및 동물 관리에 캐나다 위원회의 동물 복지 지침에 따라 수행 했다.
1. 사전 준비 (선택 사항: 1 일을 사전에 준비)
<ol><li>세 가지 유형의 인공 척수 (실제) 솔루션 (일반, 자당 및 복구 솔루션, 1 L 각; 표 1참조)를 준비 합니다. 300 ± 10 mOsm25 솔루션의 osmolality 조정 하 고 실제 자당 근처 빙 점 아래로 냉각 (0-4 ° C). 참고: 낮은 나트륨 절단 솔루션 (실제-자당)를 사용 하 여 급성 조각26의 표면 층에 있는 뉴런의 생존 능력을 유지 도움이 됩니다.</li>
	<li>준비 빨간색 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사-594)를 포함 하는 패치 솔루션의 0.75 mL와 녹색 합성 칼슘 표시기 (예를 들어, 오 레 곤 그린 BAPTA-1, 표 1참조). Biocytin 포함 ( 표 1참조)에 기록 된 셀의 임시 게시물 형태학 식별이 필요한 경우 패치 솔루션.</li>
	<li>280 ± 5 mOsm 해결책의 pH를 7.35 ± 0.5 osmolality를 조정 합니다. 항상 솔루션 또는 얼음에 냉장고에서 유지. 참고: 칼슘 표시기의 선택 해야 수 입각 한 동적 범위와 조사 캘리포니아2 + 이벤트의 성격.</li>
	<li>≈ 2 µ m 팁 (3-5 m ω의 저항 피 펫)와 붕 세타-유리 모 세관 (참조 테이블의에서 자극 펫 패치 펫에서 붕 규 산 유리 모 세관 ( 재료의 표참조)를 준비 하는 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여, 재료) 2-5 µ m 팁. 참고: 주어진된 직경 및 모양의 펫을 끌어당기는 설정은 끌어당기는 필 라 멘 트 유형 및 유리의 특정된 유형에 대 한 램프 테스트 결과 따라 결정 됩니다.</li>
</ol>2. hippocampal 슬라이스 준비
<ol><li>Anesthetize 마우스 (P13-20, 스트레인 및 마우스의 성 실험 질문 해결 되 고에 의해 결정 됩니다) isoflurane 흡입 마 취 법 챔버 내의 종이 타월에 배치의 1 mL와 함께. 동물 취 깊이 움직임과 느린 호흡의 부족에 의해 입증으로 때 마 취 법 상공에서 그것을 제거 하 고는 단두대를 사용 하 여 목을 벨.</li>
	<li>코에 두개골의 뒤에서가 위의 작은 쌍으로 피부를 절단 하 여 두개골을 노출 합니다. Bregma 수준에서 구멍을 미니 뼈 rongeurs의 작은 쌍을 사용 합니다. 그런 다음가 위를 사용 하 여 화살 봉합을 따라 꼬리-rostral 컷을 만들기 위해. rongeurs와 뒷면 각 두개골 플랩 리프트 상승 및 바깥쪽 각 반구를 덮고 두개골을 제거 하 파악.</li>
	<li>두뇌 완전히 노출 후 작은 주걱으로 시 신경 약화. 두개골에서 뇌를 제거 하 고 지속적으로 산소, 차가운 실제 자당을 포함 하는 배양 접시에 넣어 (자당 농도 표 1 참조).<ol>
<li>더 오래 된 쥐에서 조직에 필요한 경우는 intracardiac 관류 뇌 추출 전에 차가운 실제 자당의 20 mL 가득 주사기 (25 G) 좋은 품질 슬라이스를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출한 동물 두뇌에서 hippocampal 조각을 준비.<ol>
<li>약 2 분에 대 한 뇌 진정 얼음 포장 페 트리 접시에 필터 종이, 필터 종이에 두뇌를 전송 하자. 두 개의 반구를 해 부.</li>
		<li>Vibratome 테이블에 (방향 화관, 횡단, 또는 수평 분할을 얻기 위해 실험 목표에 의해 결정 됩니다) 해 부 반구를 접착제와 차가운 산소 실제 자당 가득 vibratome 트레이에 몰입할. Vibratome 트레이 주위 얼음 배치 또는 vibratome 쿨러를 사용 하 여 300 µ m 약 1 ° C의 온도에서 두꺼운 조각을 확인 합니다.</li>
		<li>37 ° c가 열 산소 실제 복구를 포함 하는 목욕에서 해 마 (반구 당 최대 6 조각)를 포함 하는 조각 축적 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여</li>
		<li>적어도 45 분 동안 실제 복구 목욕에서 슬라이스를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 전체 셀 패치 클램프 기록
<ol><li>목표에서 배치 하는 목욕에서 hippocampal 슬라이스를 설정 (배율: 40 x, 숫자 조리개: 0.8) 레이저 스캔 2 광자 현미경의. 지속적으로 산소 실제 정상에 2.5-3 mL/min의 속도로 30-32 ° C에 온수로 목욕을 perfuse.</li>
	<li>적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 또는 Dodt-SGC 현미경에 사용 하 여 관심의 크기, 모양 및 위치를 사용 하 여 셀을 찾습니다. 참고: 대상된 신경 인구에 따라 유전자 변형 마우스 모델 관심사의 세포를 쉽게 찾으려면 사용할 수 있습니다. 이 경우에,이 단계는 형광 광원의 사용으로 교체하실 수 있습니다.</li>
	<li>(예를 들어, 알 렉 사-594) 빨간 fluorophore를 포함 하는 실제 일반 솔루션에 자극 피 펫을 채우십시오.</li>
	<li>팁의 셀과 같은 지역에 되도록 조각 위에 자극 피 펫 (전기 자극 장치에 연결 된)을 설정 합니다.</li>
	<li>패치 솔루션 패치 피 펫을 채우는 머리 단계에 그것을 연결 후, 설정 조각에는 그것의 팁의 셀 바로 위에.</li>
	<li>3 방향 자 지에 주사기를 맞게 하 고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피 펫을 연결. 패치 피펫으로 지속적인 긍정적인 압력 주입 (≈ 0.1 mL) 주사기를 사용 하 여. "가까운" 위치에 있는 자 지를 계속.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈을 활성화 하 고 "VC" 버튼을 클릭 하 여 전압 클램프 모드를 전환할. Electrophysiological 신호 수집을 위한 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 (예, clampex)를 오픈 하 고 지속적으로 모니터링 하는 데 필요한 사각형 전압 펄스 (5 mV, 10 ms)를 보내 그것을 "막 테스트" 아이콘을 클릭 피 펫 저항 변화입니다.</li>
	<li>오른쪽 상단에 대상된 셀의 될 때까지 패치 피 펫을 낮춥니다. 제작 시 세포 막과 접촉, "열기" 위치로 자 지를 설정 하 여 압력을 제거. 참고: 세포 막과 접촉 감지 때 피 펫 저항에 작은 증가 (≈ 0.2 m ω) 볼은 셀에 작은 들여쓰기는 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 고.</li>
	<li>자 지에 적합 해 소프트웨어에서 제공 하는 피 펫 저항 1 GΩ에 도달할 때까지 빈 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간의 부정적인 압력을 적용 됩니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ' 막 테스트 ' 창에서 클램프-60 셀 mV.</li>
	<li>부정적인 압력을 적용 하는 셀 열리고 전체 셀 구성 달성 될 때까지 계속 합니다. 이 셀의 검출 (interneuron 유형에 따라 70-500 m ω 1 GΩ)에서 피 펫 저항과 ' 막 테스트 ' 창에 큰 용량 성 과도의 외관에 급격 한 변화를 기반으로 합니다.</li>
</ol>4. 2-광자 캘리포니아2 + 영상
<ol><li>흥분 성의 postsynaptic 응답에 관심이 있으면 추가 GABAA 수용 체 차단 gabazine (10 µ M) 및 GABAB 수용 체 차단 CGP55845 (2 µ M)에서 실제 목욕.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈에 "CC" 버튼을 클릭 하 여 패치 구성을 전류 클램프로 설정 하 고 전류를 depolarizing의 체세포 주사에 대 한 응답에서 셀의 발사 패턴 기록 (0.8-1.0 나, 1 s). 지표에 패치 솔루션으로 채워질 셀에 대 한 적어도 30 분을 기다립니다. 참고: 셀의 발사 패턴 및 활성 속성 사용할 수 있습니다 셀의 하위;을 식별 하 예를 들어, 빠른 급상승 셀입니다. 표시기 농도 기록 (문제 해결 참조 표 2 ) 고양이를 시작 하기 전에 보급을 통해 안정화를 위해 중요 하다.</li>
	<li>AP 갖는 고양이<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 시작 합니다. 빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다. 보이는 응답을 보장 하기 위해, AP 역전파의 효율성을 크게 GABAergic 수22거리 거부할 수 있습니다으로 먼저, 근 모 수석 (≤ 50 µ m)를 선택 합니다.</li>
		<li>'직사각형 도구'를 사용 하 여 이미지 수집 소프트웨어에서, 대상된 지역에 확대 하 고 전환 하는 "xt" (라인) 모드. 관심의 수지상 지점에 걸쳐 스캔 위치입니다. 수집 소프트웨어에서 레이저 강도 컨트롤러 2 광자 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 단지 약간 표시 기준 녹색 형광이는 최소한의 전력 레벨에서 설정 합니다.</li>
		<li>전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 '프로토콜' 창 및 이미지 수집 소프트웨어, 원하는 진폭의 체세포 현재 분사를 포함 하는 원하는 기간의 기록 재판을 만듭니다.<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 "시작 기록" 버튼을 클릭 하 고 3-10 회 지속적으로 1-2 미 반복을 위한 형광 이미지 수집을 취득. 단일 검색을 피하기 위해 photodamage 사이 대기 적어도 30 s. 모 수석 따라 여러 지점에서 linescans를 취득 하는 경우 순서 효과 피하기 위해 임의의 순서로 그들을 데리고.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically 갖는 고양이<ol>
<li>빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다.</li>
		<li>관심 있는 모 수석 위에 조각의 표면에 자극 피 펫을 설정 합니다. 천천히 낮은 자극 피 펫에 운동을 방해 하는 전체 셀 구성 하지 않으려면를 최소화. 위치는 모 수석에서 10-15 µ m에 피 펫입니다.</li>
		<li>Aspiny 모 수석에서 시 냅 스 microdomains의 위치를 시각화 하려면 이미지 수집 소프트웨어에서 전환 하는 'xt' (라인) 모드와 관심의 수지상 지점 따라 라인 위치.</li>
		<li>(의 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어) '프로토콜' 창에 이미지 수집 소프트웨어, 시험 시작 후 자극 단위는 기록 재판을 만듭니다.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 사용 하 여 버튼을 클릭 "시작 기록"를 3-5 번, 1-2 미 반복 수집을 위한 지속적으로 모 수석에 따라 스캔 30 대기 photodamage를 방지 하기 위해 검사 사이 s. 참고: 스캔 길이 갖는 이벤트의 속도 따라 조정 될 수 있다 하지만 photodamage 방지를 최소화 해야 합니다 (문제 해결 참조 표 2 ).</li>
		<li>해결 되 고 특정 질문에 따라 다른 조건 (예를 들면, 자극의 다른 강도/길이, 약리 차단, 등의 도입)에 4.5.5 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>셀 건강 악화의 흔적을 보여줍니다 때 인수를 중지:-45 아래 도발은 mV, 기준선 Ca2 + 레벨, 모 수석 (예를 들어, blebbing, 조각화; 보십시오 표 2 의 형태학 저하의에서 증가 대 한 문제 해결).</li>
		<li>셀의 형태에 예비 정보를 자극 피 펫의 위치 기록을 유지, Z-스택 빨강 채널에 셀의 취득. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 'xyz' 모드, 포함 하는 모든 프로세스와 전체 셀을 이미지를 상단 및 낮은 스택 제한을 설정. 1 µ m에서 '스텝 크기'를 설정 하 고 "시작 기록" 버튼을 사용 하 여 스택 수집 시작.</li>
		<li>때 Z-스택 인수 완료, 소프트웨어에서 "최대 투영" 옵션을 사용 하 여 스택의 모든 초점 계획을 입력 해 수집의 품질을 확인 하. 그런 다음, 천천히 조각에서 패치 피펫으로 철회.</li>
		<li>특별 게시 형태 식별에 대 한 슬라이스를 해결 하려면 신속 하 게 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여 목욕에서 슬라이스를 제거 하 고 실제 가득 페 트리 접시에 두 개의 필터 논문 사이 장소. 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션으로는 실제를 대체 하 고 밤새 4 ° C 방 또는 냉장고에 있는 요리를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunohistochemistry 포스트 Hoc 기록 된 셀의 형태학 식별
참고: 고정 PFA에서의 1 박 후 조각을 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.5%)와 인산 버퍼 (PB)에 최대 1 개월.
<ol><li>Tris 버퍼 염 분 솔루션 (TBS) 트라이 톤 X-100 (0.3%)에 슬라이스를 넣고 4 세척 (5-10 분 마다) 수행.</li>
	<li>TBS-트리톤에는 슬라이스를 넣어 1 시간에 대 한 10% 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.3%.</li>
	<li>TBS-트리톤 0.3%는 슬라이스를 넣어 1 %NGS는 Streptavidin 활용 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 546 활용 Streptavidin 1: 200)에 대 한 하룻밤 부 화.</li>
	<li>씻어 4 번 (5-10 분) tbs.</li>
	<li>현미경 슬라이드와 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지에 분할 영역을 탑재 합니다. 완전 한 세포 재건 하려면, Z취득-스택 (단계 크기: 1 µ m) 20 x 목표를 사용 하 여. 알 렉 사-546-활용 된 레이블 이미징, 543 nm 레이저와 515-560 nm 검색 필터를 사용 하 여 설정 합니다.</li>
</ol>6입니다. 고양이의 분석
<ol><li>빨간색과 녹색 채널에서 라인 이미지에 관심 (ROIs) 영역에서 형광 값을 추출 하 고 소음을 줄이기 위해 각 조건에 대해 여러 개의 반복의 값을 평균. 참고: 라인 인수는 모 수석에 따라 수행 될 때 그것은 수지상 microdomains (2-5 µ m)에 해당 하는 수 있습니다, 여러 ROIs에서 데이터를 추출 하 고 따라서 Ca2 + 신호 구획의 연구를 수 있도록.</li>
	<li>각 투자 수익에 대 한 캘리포니아2 + 진폭으로 변화를 표현. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 참고: 여기 G는 녹색 채널;에서 형광 값 G0 은 녹색 채널에서 기준선 형광 값 사전 자극 기간; R은 빨강 채널18에서 형광 값입니다. 와 2 광자 여기 매우 지역화 된 중요 한 배경 생성 하지 않습니다, 배경 형광의 빼기 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>

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<li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+upmanship%3A+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li>
<li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li>
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<li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li>
<li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li>
<li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li>
<li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li>
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저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.

여기에 나와 있는 메서드는 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 신호 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학의 결합을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 메서드는 두는 로컬 Ca2 + 고도 전기 자극 또는 backpropagating AP 수지상 세그먼트, 및 세포의 체세포 응답에 의해 evoked의 모니터링에 대 한 수 있습니다. 이렇게 하면 수지상 나무의 다양 한 부분 입력을 통합 하 고는 소마와 통신 공부 하는 훌륭한 도구. 하지만 실험의 길이, 주어진 특정 관심 dendrites의 photodamage 피하기 이미징을 위한 레이저 힘의 사용을 제한 하 여 세포 건강에 지불 되어야 합니다. 이 확대/축소 수준을 감소, 감소, 스캔 기간 및 이미지 수집 동안 스캔 속도 증가 또한 얻을 수 있습니다. 이미징 interneuron dendrites 추가적인 소개 합니다. 이러한 세포의 dendrites 없는 쪽이 있다는 모 수...

뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우1사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca2 + 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.
몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경2에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.
분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이3의 이미지를 했다. 캘리포니아2 + 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아2 + 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78. 또한, 2PLSM 기반 Ca2 + 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아2 + 신경 dendrites5,6,7,8,9,,1011에 신호.
칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아2 + 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널12 열고 dendrites와 쪽이13에 상대적으로 글로벌 캘리포니아2 + 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아2 +의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아2 +-침투성 AMPA와 kainate),6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca2 + 이벤트를 생성할 수 있습니다.
두 광자 캘리포니아2 + 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아2 +-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아2 + 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아2 +의 조합-녹색 Ca2 + 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아2 +-구분 염료는 캘리포니아2 + 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아2 +], [캘리포니아2 +]017 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. , 18. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아2 + 농도19의 점에서 측정 될 수 있다.
급성 조각에서 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아2 + 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아2 + 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아2 + 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아2 + 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca2 + 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.
우리는 캘리포니아2 + 변동 GABAergic 수9,,1011,,2021 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 방법 적응 , 22. 초기 캘리포니아2 + 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포20 에 그 고유 기능 캘리포니아2 + 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 , 23 , 24. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아2 + 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아2 + 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아2 + 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아2 + 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.
이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어

<table><tbody><tr><td>동물 균주: 마우스 CD1</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie Corporation</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP 55845 하이드로클로라이드</td><td>Abcam</td><td>ab120337</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도당&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 분말, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>글루콘산 칼륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>설탕&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염산염&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 이수화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> 인산나트륨 monobasic 일수화물&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> 아데노신 삼인산(ATP)-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> 구아노신(GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green BAPTA-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> 포스포크레아틴 디(트리스) 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-conjugated Alexa-546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> 패치 붕규산 유리 모세 필러리</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> Theta 붕규산 유리 모세 필러리</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 컨포칼 다광자 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Sapphire 다광자 레이저&nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF 이미징 수집 소프트웨어</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 온도 컨트롤러 TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A 디지타이저</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal 번역</td>자 <td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp 데이터 수집 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 정전류 자극 아이솔레이터</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vibraplane 광학 테이블</td><td>운동 시스템</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

칼슘 (캘리포니아2 +) 이미징 신경 모 수석에 세포내 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 역학 조사 하는 강력한 도구입니다. 캘리포니아2 + 변동 막과 세포내 메커니즘의 다양 한 통해 발생 하 고 시 냅 스가 소성의 유도 및 수지상 흥분의 규칙에 중요 한 역할을 담당할 수 있습니다. 따라서, 수지상 지점에서 서로 다른 유형의 Ca2 + 신호를 기록 하는 기능 모 수석 정보를 통합 하는 방법을 공부 하는 그룹에 대 한 가치가 있다. 두 광자 현미경의 출현이 했다 이러한 연구를 훨씬 쉽게 이미징 산란 등 photodamage 살아있는 조직에 내재 된 문제를 해결 하 여. 또한, 기존의 electrophysiological 기법 2 광자 캘리포니아2 + 이미지의 조합를 통해 수는 로컬 Ca2 + 변동에 녹음과 동시에 신경 모 수석에서 시 냅 스 활동의 조사 소마입니다. 여기, 우리가 GABAergic 금지 수의 dendrites에이 메서드를 사용 하 여 로컬 Ca2 + 과도 (고양이)의 역학을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에서 신경 종류에 신호에 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 고양이 체세포 현재 분사와 해 마의 CA1 영역에서 oriens/alveus 수의 모 수석에 전기 자극을 갖는 얻은. 여러 점에서 근 모 수석에 걸쳐 linescans 획득 후에 그것의 모양 및 위치에 따라 식별 신경, 패치, 소마 (그림 1A)에서 거리에 주어진. 우리 고양이 소마 증가 (감소 AP 진폭 또는 칼슘 채널 유통, 그림 1B에 거리 의존 감소 지표)에서 거리로 backpropagating APs에 의해 유도 된의 진폭에 있는 감소는 관찰. Immunohistochemistry (를 사용 하 여 알 렉 사 Fluor 546 Streptavidin 활용), 후 biocytin 셀의 라벨을 검색 하 여 동일시 기록된 신경 bistratified 셀으로 축 삭 oriens 지층과 지층 radiatum (<stro...

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

이 실험의 전반적인 목표는 수상돌기의 이광자 칼슘 이미징과 병행하여 뉴런 소마의 전체 세포 패치 클램프 기록을 사용하여 다양한 자극 패러다임에 대한 반응으로 뉴런 수상돌기의 칼슘 상승을 연구하는 것입니다. 이 방법은 작은 수지상 구획에서 칼슘 신호를 모니터링하는 데 사용할 수 있으며, 시냅스 입력이 통합되는 동안 수지상 가지에서 발생하는 과정을 면밀히 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘 신호 패턴을 높은 시공간 해상도와 특이성으로 관찰할 수 있다는 것입니다.지속적으로 산소가 공급되는 차가운 ACSF-자당이 들어 있는 페트리 접시에 마우스 뇌를 놓습니다. 추출한 뇌에서 해마 조각을 준비하려면 약 2분 동안 뇌를 식힌다. 그런 다음 얼음으로 채워진 페트리 접시에 여과지 한 조각을 놓고 뇌를 여과지에 옮깁니다.그런 다음 뇌를 두 개의 반구로 해부합니다. 절개된 반구를 비브라톰 절편 플랫폼에 붙이고 얼음처럼 차가운 산소가 공급된 ACSF-수크로오스로 채워진 절편 트레이에 담그십시오. 그런 다음 300마이크로미터 두께의 단면을 비브라톰 쿨러를 사용하여 섭씨 1도에서 자르거나 비브라톰 트레이 주위에 얼음을 놓습니다.페인트 브러시를 사용하여 해마가 포함된 조각을 섭씨 37도까지 가열된 산소가 공급된 ACSF 회수 욕조로 옮깁니다. 이 단계에서는 해마 절편을 레이저 스캐닝 이광자 현미경의 대물렌즈 아래에 있는 수조로 옮깁니다. 산소가 공급된 ACSF-normal로 욕조를 지속적으로 관류하십시오.그런 다음 적외선 미분 간섭 대비 현미경을 사용하여 크기, 모양 및 위치를 사용하여 관심 세포를 찾습니다. 그 후, 적색 형광단을 함유한 ACSF-normal 용액으로 자극 피펫을 채웁니다. 끝이 관심 셀과 동일한 영역에 있도록 슬라이스 위로 내립니다.그런 다음 패치 피펫에 패치 용액을 채우고 헤드 스테이지에 부착합니다. 끝이 관심 있는 셀 바로 위에 오도록 슬라이스 위에 놓습니다. 그런 다음 주사기를 3방향 마개에 끼우고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피펫에 연결합니다.패치 피펫에 일정한 양압을 주입하고 스톱콕을 가까운 위치에 유지합니다. 그런 다음 MultiClamp 증폭기 제어 소프트웨어 모듈을 열고 VC 버튼을 클릭하여 전압 클램프 모드로 전환합니다. 전기생리학적 신호를 기록하기 위한 전기생리학 Clampex 데이터 수집 소프트웨어를 열고 멤브레인 테스트 아이콘을 클릭하여 파이펫 저항의 변화를 모니터링하기 위한 일정한

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

의 연결을 네트워크를 개발 자발적인 활동은 칼슘에 민감한 지표 염료의 AM - 에스테르 양식을 사용하여 측정할 수 있습니다. 의 연결을 활성화를 나타내는 세포 내 칼슘의 변화는 하나 또는 두 개의 광자 이미징과 형광 표시기에 일시적 변화로 감지됩니다. 이 프로토콜은 발달 종속의 연결 네트워크의 범위에 대해 적용할 수...

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을...

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

이 비디오는 뇌 해마 절편에서 전체 세포 패치 클램프 기록 및 이광자 칼슘 이미징을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 급성 뇌 절편에서 다양한 뉴런 유형의 수상돌기에서 국소 Ca2+ 과도 현상(CaT)의 역학을 연구할 수 있습니다.

뇌 절편의 이광자 칼슘 이미징을 위한 전체 세포 구성 확립

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

학습하세요 두뇌 조각에서 전체세포 패치클램프 기록과 2광자 칼슘 이미징을 결합하여 수상돌기의 칼슘 역학을 고해상도로 관찰하는 방법을. 이 기술은 시냅스 통합 과정과 신경 가소성 연구에 필수적입니다.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

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