Espectrometria de massa MALDI-TOF
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Panoramica
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz (MALDI) é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. Em vez de compostos ionizantes no estado gasoso, as amostras são incorporadas em uma matriz, que é atingida por um laser. A matriz absorve a maior parte da energia; parte dessa energia é então transferida para a amostra, que ioniza como resultado. Os íons de amostra podem então ser identificados usando um analisador de tempo de voo (TOF).
Este vídeo abrange princípios do MALDI-TOF, incluindo a seleção de matrizes e como o TOF é usado para elucidar as relações massa-carga. Este procedimento mostra a preparação de uma placa MALDI, o carregamento de amostras na placa e o funcionamento do espectrômetro de massa TOF. Na seção final, são mostradas aplicações e variações, incluindo análise de células inteiras, caracterização de amostras biológicas complexas e ionização de spray de elétrons.
A ionização de desorpção a laser assistida por matriz, ou MALDI, é uma fonte de íons de espectrometria de massa ideal para a análise de biomoléculas. A maioria das fontes de íons remove informações estruturais de grandes e frágeis biomoléculas. O MALDI mantém a integridade estrutural e, portanto, a informação, acelerando as moléculas no analisador de massa, que separa os compostos com base no tamanho e na carga. O mais comumente acoplado com MALDI é o tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Este vídeo mostrará os conceitos de ionização maldi, um procedimento geral e alguns de seus usos na bioquímica.
Para que a espectrometria de massa funcione, as moléculas devem ser ionizadas para o estado gasoso. No MALDI, a amostra é incorporada em uma matriz, tipicamente um composto orgânico contendo ligações duplas aromáticas e conjugadas.
Quando um pulso de laser atinge essa mistura, a matriz absorve a maior parte da energia, aquece rapidamente, e é desordenada, ou liberada, da superfície. A matriz energizada transfere parte de sua energia para as biomoléculas, desordenando e, em seguida, ionizando-as.
Maldi é tipicamente emparelhado com um tempo de voo, ou TOF, analisador em massa. Um campo elétrico aplica energia cinética aos íons, movendo-os para uma região livre de campo chamada tubo de deriva. A velocidade dos íons enquanto se movem através do tubo está relacionada com sua relação massa-carga, de modo que partículas mais pesadas viajam mais lentamente através do instrumento. Um detector no final do tubo mede o tempo de voo de cada íon. Com esse conhecimento, bem como o comprimento do tubo e a força de campo aplicada, a relação massa-carga de cada íon pode ser elucidada.
Este gráfico de intensidade de sinal para a relação massa-carga, conhecido como espectro de massa, pode ser comparado a uma biblioteca de espectros coletados. Se não forem encontradas correspondências, podem ser identificadas moléculas por outras técnicas, como espectrometria de massa tandem. Para mais informações, consulte o vídeo desta coleção sobre o tema.
Agora que os fundamentos do MALDI-TOF foram discutidos, vamos olhar para o processo em laboratório.
Antes de iniciar um experimento, é importante considerar a escolha da matriz de qual as amostras serão desordenadas. Ele deve absorver a energia laser, ser estável no vácuo, não reagir com as moléculas alvo, e ser capaz de desorb. Dependendo da amostra, são preferidas diferentes matrizes. Para uma proteína grande, uma combinação de CHCA e DHB tem mostrado melhor separação dos picos, chamada resolução, do que as matrizes individuais.
Há várias maneiras de preparar amostras. Vamos mostrar o que é conhecido como “dupla camada”, ou “sanduíche”, método. Para começar, limpe a placa MALDI com reagentes ultra-puros, pois a espectrometria de massa é muito sensível à contaminação. Seque a placa com um fluxo de gás inerte.
Em seguida, uma solução de matriz saturada é feita, tipicamente com um solvente orgânico. A solução é listrada na placa MALDI e seca. Uma segunda solução saturada de matriz contendo ácido trifluoroacético, ou TFA, é preparada. TFA ajuda íons na fase gasosa.
Em seguida, a solução amostral é adicionada em cima do ponto de matriz seca. Adicione a solução de matriz contendo TFA em cima da amostra, completando assim a matriz “sanduíche”. A homogeneidade do local pode ser verificada sob um microscópio de baixa potência.
Emplaque um padrão de calibração, que é uma mistura com uma ampla gama de massas conhecidas e é usado para correlacionar o tempo de voo para m/z. Finalmente, emplaque a matriz sozinho como um controle negativo.
Para analisar as manchas, coloque a placa alvo no instrumento. Certifique-se de que não há detritos presentes, permitindo a formação de um vácuo apertado. No software, selecione o padrão, controle negativo e amostras de interesse. Rotule as manchas com a identificação correta.
A fonte de íon e as tensões das lentes podem ser manipuladas para melhorar o desempenho da análise. Isso dependerá das especificidades do instrumento e da amostra. Concentre-se no ponto padrão e calibrar o instrumento com o software.
Em seguida, colete espectros de cada um dos pontos amostrais. Experimente alguns locais diferentes no local para maximizar a qualidade dos dados coletados. Uma vez concluída, a placa MALDI pode ser coletada e reutilizada após a limpeza.
Agora que revisamos um procedimento, vamos ver algumas das maneiras como o MALDI é utilizado, e uma técnica de ionização diferente.
Além das biomoléculas, o MALDI pode ser usado para analisar células vivas. Macrófagos são células imunes que assumem uma das várias formas diferentes, com base em seu microambiente. Depois de expor as células a várias moléculas de sinalização, ou citocinas, elas podem ser adicionadas diretamente à placa, e analisadas. O espectro MALDI pode ser usado como “impressões digitais” únicas, dependendo da citocina usada.
Amostras biológicas complexas como secreções sebáceas de mamíferos requerem um passo de purificação antes da análise maldi. A cromatografia de camada fina é uma dessas técnicas que se baseia na polaridade dos componentes. Os compostos são coletados do patê TLC, purificados e transferidos para uma matriz MALDI. Os espectros resultantes verificam a identidade e pureza das biomoléculas separadas das secreções sebáceas dos mamíferos.
Outra fonte comum de íons para biomoléculas é a ionização eletrospray, ou ESI. Neste método, a amostra é injetada no instrumento, onde uma alta tensão é aplicada, criando um aerossol de gotículas carregadas. À medida que o solvente na gotícula evapora, a carga é movida para as moléculas da amostra, até que elas sejam completamente gasosas. O ESI não requer o procedimento de manchas, e a amostra pode ser injetada diretamente no instrumento. Por outro lado, o ESI é mais sensível à presença de componentes tampão e outros contaminantes, o que significa que o MALDI é mais robusto.
Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre espectrometria de massa MALDI. Este vídeo descreveu a teoria por trás do instrumento, passou por cima de um procedimento geral, e cobriu alguns dos usos da técnica. Obrigado por assistir!
Procedura
Divulgazioni
Trascrizione
Matrix-assisted laser desorption ionization, or MALDI, is a mass spectrometry ion source ideal for the analysis of biomolecules. Most ion sources remove structural information from large, fragile biomolecules. MALDI maintains structural integrity, and therefore information, while accelerating the molecules into the mass analyzer, which separates the compounds based on size and charge. The most commonly coupled with MALDI is the time of flight, or TOF, mass analyzer. This video will show the concepts of MALDI ionization, a general procedure, and some of its uses in biochemistry.
For mass spectrometry to function, molecules must be ionized into the gaseous state. In MALDI, the sample is embedded in a matrix, typically an organic compound containing aromatic and conjugated double bonds.
When a laser pulse strikes this mixture the matrix absorbs the majority of the energy, rapidly heats, and is desorbed, or released, from the surface. The energized matrix transfers some of its energy to the biomolecules, desorbing and then ionizing them.
MALDI is typically paired with a time of flight, or TOF, mass analyzer. An electric field applies kinetic energy to the ions, moving them into a field-free region called a drift tube. The velocity of the ions as they move through the tube is related to their mass-to-charge ratio, so heavier particles travel slower through instrument. A detector at the end of the tube measures each ion’s flight time. With this knowledge, as well as the tube length and applied field strength, the mass-to-charge ratio of each ion can be elucidated.
This plot of signal intensity to mass-to-charge-ratio, known as a mass spectrum, can be compared to a library of collected spectra. If no matches are found, it can molecules can be identified by further techniques, such as tandem mass spectrometry. For more information, see this collection’s video on the topic.
Now that the basics of MALDI-TOF have been discussed, let’s look at the process in the laboratory.
Before beginning an experiment, it’s important to consider the choice of matrix from which samples will be desorbed. It must absorb the laser energy, be stable in a vacuum, not react with the target molecules, and be able to desorb. Depending on the sample, different matrices are preferred. For a large protein, a combination of CHCA and DHB has shown better separation of the peaks, called resolution, than the individual matrices.
There are a number of ways to prepare samples. We’ll show what is known as the “double-layer”, or “sandwich,” method. To begin, clean the MALDI plate with ultra-pure reagents, as mass spectrometry is very sensitive to contamination. Dry the plate with a stream of inert gas.
Next, a saturated matrix solution is made, typically with an organic solvent . The solution is streaked onto the MALDI plate and dried. A second saturated solution of matrix containing trifluoroacetic acid, or TFA, is prepared. TFA helps ions into the gaseous phase.
Next, the sample solution is added on top of the dried matrix spot. Add the matrix solution containing TFA on top of the sample, thereby completing the matrix “sandwich”. Homogeneity of the spot can be verified under a low-powered microscope.
Plate a calibration standard, which is a mixture with a wide range of known masses and is used to correlate the time-of-flight to m/z. Finally, plate the matrix alone as a negative control.
To analyze the spots, place the target plate into the instrument. Ensure there’s no debris present, allowing for the formation of a tight vacuum. In the software, select the standard, negative control, and samples of interest. Label the spots with the correct identification.
The ion source and lens voltages can be manipulated to improve performance of the analysis. This will depend on the specifics of the instrument and sample. Focus on the standard spot and calibrate the instrument with the software.
Next, collect spectra from each of the sample spots. Try a few different locations on the spot to maximize the quality of the collected data. Once finished, the MALDI plate can be collected and reused after cleaning.
Now that we’ve reviewed a procedure, let’s look at some of the ways MALDI is utilized, and a different ionization technique.
In addition to biomolecules, MALDI can be used to analyze living cells. Macrophages are immune cells that take on one of several different forms, based on their microenvironment. After exposing the cells to various signaling molecules, or cytokines, they can be added directly to the plate, and analyzed. The MALDI spectra can be used as unique “fingerprints”, depending on the cytokine used.
Complex biological samples like mammalian sebaceous secretions require a step of purification before MALDI analysis. Thin layer chromatography is one such technique that relies on the components’ polarity. The compounds are collected from the TLC pate, purified, and transferred to a MALDI matrix. The resulting spectra verify the identity and purity of the separated biomolecules from the mammalian sebaceous secretions.
Another common ion source for biomolecules is electrospray ionization, or ESI. In this method, the sample is injected into the instrument, where a high voltage is applied, creating an aerosol of charged droplets. As the solvent in the droplet evaporates, the charge is moved to the sample molecules, till they are completely gaseous. ESI doesn’t require the spotting procedure, and the sample can be injected directly into the instrument. On the other hand, ESI is more sensitive to the presence of buffer components and other contaminants, meaning MALDI is more robust.
You’ve just watched JoVE’s video on MALDI mass spectrometry. This video described the theory behind the instrument, went over a general procedure, and covered some of the uses of the technique. Thanks for watching!
