Anne sütü artırır büyüme Enteroids: hücre çoğalması bir Ex Vivo modeli

Bu prosedürün genel amacı, laboratuvarda enteroid adı verilen minyatür bağırsakları kültürlemektir. Enteroidler, anne sütünün in vitro proliferasyon üzerindeki etkilerini aydınlatmak için laboratuvarda ekstrakte edilen fare anne sütü ile tedavi edilir. Bu yöntem, prematüre bebekleri etkileyen nekrotizan enterokolit gibi çeşitli gastrointestinal hastalıklarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, enteroidlerin çok az bakım gerektirmesi, hızlı bir şekilde kurulabilmesi ve gastrointestinal epitelin fonksiyonel özelliklerinin çoğunu sergilemesidir. Enteroidlerin kurulması için bu teknik, insan ince bağırsağının oldukça etkili bir modelidir. Bu yöntem ince bağırsak hakkında bilgi verebilse de, GI yolunun diğer bölgelerindeki diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.

Başlamak için, çözünmüş bazal membran ekstraktını buz üzerinde çözün. Ardından, ötenazi uygulanmış bir farenin tüm karın orta hattında dikey bir kesi yapmak için makas ve forseps kullanın. Forseps kullanarak ince bağırsağı eksize edin ve mezenteri çıkarın.

İnce bağırsağı kript izolasyonu ve enteroid oluşumu için hazırlamak için, bağırsağı düz bir şekilde konumlandırın ve tüm uzunluğu boyunca uzunlamasına kesmek için makas kullanın. PBS antibiyotik karışımı ile doldurulmuş bir Petri kabında bağırsağı forseps ile hafifçe sallayarak herhangi bir dışkıyı çıkarın. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 30 mililitre hücre bozulma ortamı ekleyin.

Yarım santimetrelik bağırsak segmentlerini tüpe yerleştirin ve tüpü bir çalkalayıcı üzerindeki bir buz kovasına yerleştirin. Bir davlumbazda, sekiz kuyulu bir oda slaytında her bir kuyunun dibine 9 mikrolitre bodrum membranı ekleyin. Membranı bir pipet ucuyla hızlı bir şekilde yayın ve bazal membranın bir inkübatörde polimerize olmasına izin verin.

Bodrum membranının, kuyu dibinde ince bir tabaka oluşturacak şekilde hızlı bir şekilde yayılması önemlidir. Hava kabarcıkları varsa veya bazal membran çok kalınsa kriptler yapışmaz. Konik boruyu çalkaladıktan sonra, membran dokusunu filtrelemek ve akışı atmak için 100 mikrometrelik bir süzgeç kullanın.

Yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe iki numaralı 30 mililitre hücre bozulma ortamı ekleyin ve ardından bağırsak dokusunu tüpe ekleyin. Tüpü 15 dakika çalkaladıktan sonra, dokuyu 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün. Akışı bu adımdan itibaren tutun.

Yeni bir konik tüpe litre başına 4.5 gram glikoz ve L-glutamin içeren 15 mililitre TMEM ekleyin. 100 mikrometre süzgecinden dokuyu çıkarın ve yeni konik tüpe ekleyin. Ardından, tüpü 10 saniye boyunca manuel olarak çalkalayın ve 100 mikrometrelik bir süzgeçten süzün.

Başlıkta, dokuyu yeni bir konik tüpe filtrelemek için 70 mikrometrelik bir süzgeç kullanın. Tüpü 8 dakika santrifüjledikten sonra, davlumbazdaki bir buz kovasına yerleştirin. Oluşan peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın.

Peletleri, büyüme faktörleri olmadan uygun miktarda kript kültürü ortamı ile yeniden süspanse edin. Hazne slaytını 30 dakika inkübe ettikten sonra, kript ortam karışımını doğrudan bazal membranın üzerine yerleştirin ve kriptler yapışana kadar 37 santigrat derecede 3 saat inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, herhangi bir ortamı ve bağlı olmayan kriptoları dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın.

Bir diğer kritik adım, bir P200 pipeti kullanılarak takılamayan ortamı ve fazla kriptleri yavaşça çıkardığınızdan emin olmaktır. Bağlı kriptler yerinden çıkabileceğinden bazal membranı rahatsız etmeyin. Her oyuğa yavaşça büyüme faktörleri içeren 250 mikrolitre kript kültürü ortamı ekleyin.

Burun konisi yoluyla verilen izofluran ile emziren bir barajı uyuşturun ve uygun dozda deri altı oksitosin uygulayın. Emzikleri %70 etanol ile temizleyin ve sağım işlemine başlamadan önce kurumasını bekleyin. Farelere uyacak şekilde boyutlandırılmış silikon boru ve 5 mililitrelik bir tüp ile donatılmış bir elektrikli insan göğsü pompası kullanarak, meme başlarından birer birer süt alın.

Son olarak sütü hemen kesin ve eksi 80 derecede saklayın. Enteroidleri beşinci günde 37 santigrat derecede 24 saat boyunca depolanmış fare anne sütü ile tedavi edin. Boyamanın ilk gününde, deneysel tedavileri çıkarmak ve enteroidleri yıkamak için PBS kullanın.

Her bir oyuğa 250 mikrolitre% 4 PFA ekleyin ve slaytı 4 santigrat derecede 1 ila 2 saat boyunca bir döndürücüye yerleştirin. PFA'yı çıkarmak için bir pipet kullanın ve ardından her bir kuyuyu 250 mikrolitre PBS ile dört kez nazikçe yıkayın. Hazne sürgüsünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir döndürücü üzerine yerleştirin.

Her oyuğa 250 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübe ettikten sonra, Triton X-100'ü bir pipetle çıkarın ve her kuyucukta 250 mikrolitre PBS ile dört kez yıkayın. Slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin.

Her kuyucuğa 250 mikrolitre %10 NDS/PBST ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra NDS/PBST'yi bir pipetle çıkarın. Son olarak, her oyuğa 250 mikrolitre seyreltilmiş primer antikor ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Boyamanın ikinci gününde, her bir kuyuyu en az beş kez 250 mikrolitre PBST ile yıkayın ve slaytı her yıkama arasında 4 santigrat derecede bir döndürücüye yerleştirin. Her oyuğa %1 NDS / PBST'de 250 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Slaytı folyoya sarın ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.

Boyamanın son gününde, her bir oyuğa 250 mikrolitre nükleer lekeli DAPI ekleyin ve 15 dakika bekletin. Ardından, her bir kuyuyu altı kez 250 mikrolitre PBST ile yıkayın. Slaytı, her yıkama arasında 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir döndürücüye yerleştirin.

Son olarak, montaj ortamı ile hazne sürgüsüne bir kapak sürgüsü monte ederek ve 24 saat kurumasını bekleyerek sürgüyü mikroskobik görüntüleme için hazırlayın. Bu çalışmada, yenidoğan farelerden türetilen ince bağırsak enteroidleri, emziren farelerden toplanan anne sütü ile tedavi edildi. Bu şekilde gösterildiği gibi, fare anne sütü, fare enteroidlerinde proliferasyonu arttırdı.

Anne sütünün türe özgü etkilerini araştırmak için, anne sütü ve pastörize donör anne sütü de fare enteroidlerine uygulandı. Bu şekilde gösterildiği gibi, insan ve pastörize donör anne sütü, fare enteroidlerinin proliferasyonunu arttırmıştır. Bu prosedürü denerken, izolasyon adımları sırasında kriptleri buz üzerinde tutmak önemlidir.

Enteroidler kültüre girdikten sonra tüm yöntemleri yavaş ve nazikçe uygulayın. Bu prosedürü takiben, bağırsağın mikro ortamını daha iyi özetlemek için ek soruları yanıtlamak için bağışıklık hücreleri, mikrobiyota veya çeşitli ilaçlarla tedaviler gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, enteroidler üzerinde nasıl kültürleneceğini, tedavi edileceğini ve immünofloresan uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Ek olarak, emziren bir fareden anne sütünü verimli bir şekilde çıkarabilmelisiniz. İnsan dokusu ve vücut sıvıları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürleri gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın.