בידוד של תאים דנדריטים האדם באיברי הרבייה הנקביים ללימודי פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאים דנדריטיים מתאים אנטומיים שונים במערכת הרבייה הנשית האנושית כדי להעריך את המאפיינים הפנוטיפיים והתפקודיים שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתאים דנדריטיים השוכנים ברקמות בדרכי המין הנשיות, כגון מידור אנטומי של תת-קבוצות ספציפיות והמאפיינים התפקודיים שלהן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפרוטוקול עיכול הרקמות שלנו אינו מבקע סמני פני השטח, מה שמאפשר בידוד מיידי של תאים דנדריטיים ללא דגירה או הפעלת תאים למשך הלילה.

בעוד ששיטה זו עברה אופטימיזציה לבידוד תאים דנדריטיים ממערכת הרבייה הנשית האנושית, ניתן להתאים אותה גם לבידוד תאים חיסוניים אחרים או תאים דנדריטיים מרקמות אחרות. ידגימו את ההליך פיונה בר וג'ארד פורטייה, טכנאים במעבדה שלנו. התחל הליך זה על ידי שטיפת הרקמה עם HBSS שונה.

מניחים את הרקמה בצלחת פטרי בגודל 100 על 15 מילימטר מרובע, ומוסיפים כשלושה מיליליטר של קוקטייל אנזימי עיכול כדי למנוע מהרקמה להתייבש. תוך כדי שימוש במלקחיים לייצוב הרקמה, טחנו אותה באזמל כדי להגדיל את שטח הפנים של הרקמה החשופה לקוקטייל אנזימי העיכול. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות.

הוסף קוקטייל אנזימי עיכול מספיק כדי לכסות את כל חלקי הרקמה, והניח את המכסה על צלחת הפטרי. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני על מסובב בכ-80 סל"ד למשך 45 דקות. ודא שמהירות המסובב מערבבת היטב את קוקטייל אנזימי העיכול מבלי לשפוך או לייצר בועות.

לאחר 45 דקות, דמיינו את הכנת הרקמה במיקרוסקופ אור הפוך עם המטרות 4X ו-10X. עיכול אנזימטי מוצלח אמור לשחרר יריעות ובלוטות אפיתל, כפי שמוצג בתמונה מייצגת זו. בצע הפרדה של תאים בודדים בסביבה סטרילית.

ראשית, הניחו רשת מתוחה של 250 מיקרומטר עם מחזיק בצלחת פטרי בגודל 150 על 15 מילימטר מרובע, וודאו שהרשת נמצאת כ-0.5 סנטימטרים מעל פני השטח של צלחת הפטרי. לאחר מכן, הרטיבו את הרשת בשני מיליליטר של HBSS שונה, והעבירו את הרקמה המעוכלת לרשת. בעזרת המשטח השטוח של בוכנת מזרק של 10 מיליליטר, טוחנים בעדינות אך בחוזקה את הרקמה הטחונה המעוכלת דרך הרשת.

לאחר ששברי הרקמה התפזרו ביסודיות, הרם את הרשת ואת המחזיק שניים עד שלושה סנטימטרים מעל צלחת הפטרי, ושטוף עם שלושה מיליליטר של HBSS מותאם כדי לשחזר תאים נוספים. העבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הניחו רשת של 20 מיקרומטר עם מחזיק כשניים עד שלושה סנטימטרים מעל צלחת פטרי חדשה, ורטיבו עם שני מיליליטר HBSS שונה.

העבירו את תרחיף התא דרך הרשת, ושטפו עם שישה מיליליטר HBSS שונה. אוספים את תרחיף התאים המעורבים, והצנטריפוגה ב -500 פעמים גרם למשך 10 דקות. שאפו את הנוזל והשעו מחדש את הכדור בארבעה מיליליטר של HBSS שונה.

שכב את תרחיף התאים המעורבים על שלושה מיליליטר של תמיסת פוליסוכרוז לצנטריפוגה בשיפוע צפיפות. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 500 פעמים גרם למשך 30 דקות ללא בלם. אוספים את הרצועה הלבנה מהחלק העליון של תמיסת הפוליסוכרוז, ושוטפים עם PBS.

לאחר איסוף תרחיף התאים המעורבים המועשר, ספור את התאים באמצעות המוציטומטר במיקרוסקופ אור עם המטרה פי 10. סובב את כל התאים בתרחיף התא למשך 10 דקות. שאפו לחלוטין והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, הוסיפו חרוזים להסרת תאים מתים, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, הנח מסנן של 30 מיקרומטר על גבי העמודה כדי לשמור על שאריות רקמות או אגרגטים של תאים. שטפו את המסנן והעמוד עם מאגר להסרת תאים מתים.

לאחר מכן, מרחו את תרחיף התאים, ואפשרו לתאים המסומנים בחרוזים לזרום דרך העמוד המגנטי. שטפו את העמוד עם שלושה מיליליטר של מאגר להסרת תאים מתים ארבע פעמים. אסוף את הזרימה המכילה את התאים החיים.

לאחר הסרת תאים מתים, סובב את התאים כלפי מטה. הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש את גלולת התא במאגר ברירה מגנטית, 80 מיקרוליטר של חיץ לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים. לבחירה חיובית של אוכלוסיות תאים דנדריטיים, הוסיפו חרוזים מגנטיים CD1a או CD14, ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שטפו את התאים עם מאגר הבחירה המגנטית, סובבו כלפי מטה, הסירו את המאגר לחלוטין והשעו מחדש את התאים במינימום של 500 מיקרוליטר של מאגר בחירה מגנטית. חבר את העמודה למגנט, והוסף מסנן של 30 מיקרומטר על גבי העמודה כדי לשמור על כל פסולת רקמות שנותרה או אגרגטים של תאים. שטפו את המסנן והעמודה עם מאגר בחירה מגנטי.

החל את מתלה התא על העמודה. שוטפים שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר בחירה מגנטי. העבירו את העמוד לצינור של 15 מיליליטר.

הוסף חמישה מיליליטר של מאגר בחירה מגנטי, והחל את הבוכנה כדי לשחרר את התאים שנבחרו מהעמודה. כדי להגביר את הטוהר, חזור על שלבי הטיהור עם התאים המשוחזרים באמצעות עמודה חדשה. לאחר מכן, העריכו את טוהר התא על ידי זרימה ציטומטרית ומיקרוסקופיה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לפני תחילת בדיקה זו, תאי T נאיביים מבודדים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי באמצעות ערכה זמינה מסחרית. שטפו את תאי ה-T הנאיביים פעמיים עם PBS. השעו מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר PBS.

שאר הפרוטוקול מבוצע בחושך. תוך כדי מערבולת עדינה של התאים בארון הבטיחות הביולוגית, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה פי 2 של צבע התפשטות תאים לתאים. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הפסק את תיוג התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים עם סרום AB אנושי של 10%. דגירה על קרח למשך חמש דקות, מוגנת מפני אור. צנטריפוגה של התאים בערך 500 פעמים גרם למשך שבע דקות.

שאפו את המדיום, והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים עם סרום AB אנושי של 10%. לפני הצנטריפוגה האחרונה, קח מספר תאים כדי לספור. לאחר השטיפה השלישית, השעו מחדש את התאים במדיום תרבית תאים עם סרום AB אנושי של 10% בריכוז התאים הרצוי.

כדי להתחיל את התרבות המשותפת של תאי T נאיביים אלוגניים של תאים דנדריטיים, צלחו את התאים הדנדריטים המבודדים ותאי T הנאיביים בצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות ביחס של 1 ל-15 של תאים דנדריטיים לתאי T. צנטריפוגה את הצלחת בערך 500 פעמים גרם למשך שלוש דקות כדי להבטיח שהתאים ממוקמים במרכז הבאר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שישה ימים.

עקוב אחר התאים במיקרוסקופיה. לאחר שישה ימים, העריכו את התפשטות התאים על ידי זרימה ציטומטרית, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. גרף זה מציג את טווח המספר הכולל של תאים ברי קיימא ששוחזרו לאחר עיבוד רקמות והסרת תאים מתים בכל תא בדרכי הרבייה הנשיות, רירית הרחם, אנדו-צוואר הרחם ו-ectocervix.

מספר התאים הדנדריטים ברי קיימא שהתאוששו לגרם רקמה לאחר בידוד חרוזים מגנטיים מוצג בהמשך. המורפולוגיה הדנדריטית של התאים המבודדים נקבעה על ידי מיקרוסקופיה בעקבות צביעת גימסה. ביטוי של סמנים פנוטיפיים לפני ואחרי בידוד החרוזים נקבע על ידי ציטומטריית זרימה.

לאחר בידוד חרוזים חיובי ל-CD1a וחיובי ל-CD14, הטוהר נע בין 85 ל-92%בדיקת גירוי אלוגני בוצעה כדי להעריך את תפקוד התאים הדנדריטים. היווצרות אשכול תאי T במהלך התפשטות אושרה על ידי צביעת צבע התפשטות. לאחר מכן כומת השגשוג על ידי ציטומטריית זרימה.

מוצגת כאן אסטרטגיית השער לזיהוי תאים דנדריטיים שונים בתרחיף התאים המעורבים. כל אוכלוסייה מגודרת בחלקות צבעוניות מוצגת בחלונית הבאה. בעקבות אסטרטגיית השער, מזוהות תת-קבוצות ספציפיות של תאים דנדריטיים.

צפויים מספרי תאים נמוכים, מכיוון שתאים דנדריטיים של רקמות הם אוכלוסיות נדירות. לאחר השליטה, בידוד תאים דנדריטיים מהרקמות יכול להיעשות תוך ארבע עד חמש שעות אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעכל ולעבד את הרקמות באופן אנזימטי כדי ליצור תרחיף תאים מעורב יחיד ולבצע בחירת חרוזים מגנטיים של תאים דנדריטיים לאפיון נוסף.