Name: Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Apprenez à mesurer l'endoréduplication dans les tubercules de pomme de terre (Solanum tuberosum) par cytométrie de flux de protoplastes isolés. Cette méthode améliore la clarté des résultats pour étudier le développement tubéreux.

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Cette recherche a été financée par la National Science Foundation Award nombre 1237969, « Démêler l’hétérozygotie, Composition allélique et Variation numéro copie de pomme de terre » et USDA spécial Grant 2014-34141-22266 (Université du Maine) à RV

Remarque : Il est important d’inclure des contrôles appropriés, généralement sous forme de tissus foliaires de la ploïdie même comme échantillons expérimentaux. C’est parce que le pic 2C des échantillons de tubercules peut-être être petits et difficiles à identifier.
1. les préparatifs
Remarque : Les solutions énumérées ici peuvent être préparées à l’avance et conservées à 4 ° C, mais celles qui sont présentées dans les étapes suivantes doivent être faites à la fraîches le jour d’utilisation.
<ol><li>Faire un volume approprié de plasmolyse d’Incubation Solution (PIS) (15 mL/échantillon) : 0,55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris tampon pH 7,5 (ajusté avec HCl).</li>
	<li>Faire un volume approprié de Solution de lavage plasmolyse (PWS) (15 mL/échantillon) qui est identique au PIS, à l’exception de l’ajout de 0,71 M mannitol.</li>
	<li>Porter 250 mL de Flow Cytometry tampon11 (FCB de Galbraith mis à jour le) : 13,6 mM du citrate de sodium (sodium), vadrouilles de 8 mM, 18 mM MgCl2, 0,4 % v/v X-100 Triton. Remuez pendant au moins 30 min à distribuer la X-100 Triton.</li>
	<li>Stériliser de filtration solutions PWS et PIS avec un filtre de 0,22 µm asymétrique polyéthersulfone (APE). Utiliser les unités de filtration sous vide entraînée.</li>
	<li>
Préparer les 106 filtres µm pour les protoplastes lysés. Préparer le 1,5 mL tubes de microcentrifuge qui peuvent être imbriqués directement dans les tubes de prélèvement, mais n’importe quelle méthode de traverser un filtre 106 µm de suspensions peut-être être utilisé. Remarque : Il sont inutile d’être stérile.<ol>
<li>Si vous utilisez des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, couper 1 cm au large de la pointe chaque tube de microcentrifuge. À l’aide d’une plaque chauffante ou autre chaleur source de chaleur un 1 cm2 pièce 106 µm en acier de maille sur un morceau de papier d’aluminium. Enfoncez l’extrémité coupée du tube dans le maillage jusqu'à ce qu’ils ont fusionné.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver les pommes de terre à échantillonner, enlever tous les sols et les débris. NOTE : Âge et la taille des tubercules doivent être adaptées à des objectifs de l’expérience, mais ne semblent pas affecter la qualité des résultats. Nous avons avec succès appliqué ce protocole à tubercules qui ont été en chambre froide (4 ° C, 95 % RH) jusqu'à 8 mois. Alors que les tubercules présentant des défauts (par exemple tuber pourriture apicale, coeur creux, des zones nécrotiques bruns) peuvent être sensibles, ils doivent être évités, si possible.</li>
</ol>2. jour 1 : Plasmolyze Tuber tissu
Remarque : Les échantillons de feuilles de contrôle peuvent être inclus ici pour produire des protoplastes ou à l’étape 5.2 si préparations brutes sont préférées. Ceci doit être effectué avec des outils stériles en milieu aseptique, comme une hotte à flux laminaire.
<ol><li>Surface de stériliser les tubercules de pomme de terre par immersion dans de l’éthanol 75 % pendant au moins 5 min.</li>
	<li>Retirez les tubercules de l’éthanol et sécher à l’air. Cela prend habituellement environ 5 min, plu si le tubercule est supérieur à 100 g.</li>
	<li>Préparer et tubes coniques d’étiquette stérile de 50 mL pour chaque échantillon et l’aliquote 15 mL de filtre stérilisé PIS dans chacun.</li>
	<li>
Échantillon d’environ 1 cm3 du tissu désiré de tubercules stérilisés à l’aide du scalpel stérilisé ou perce-bouchon. Remarque : Selon le tissu à échantillonner, on peut utiliser soit un perce-bouchon stérile ou un couteau/scalpel. Par exemple, si la moelle est souhaitée le perce-bouchon peut être utilisée pour prendre une carotte prélevée l’apicale de l’extrémité distale du tubercule et la fraction centrale du noyau peut-être être échantillonnée. Toutefois, en raison de la morphologie interne asymétrique des tubercules de pomme de terre, il peut être plus précis au parenchyme échantillon ou cortex de réduire de moitié le tubercule et en excisant le tissu désiré. Voir la Figure 1 pour une description de la morphologie interne de tuber.<ol>
<li>Hacher grossièrement les tissus à l’aide d’un scalpel stérilisé en env. 3 mm3 morceaux et de transfert tissu à tube à fond conique contenant PIS. Incuber une nuit à 4 ° C. Remarque : Il s’agit de maximiser la surface spécifique afin que le PIS, et plus tard la solution enzymatique, peuvent pénétrer entièrement le tissu ayant pour résultat la digestion plus complète.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Figure 1 : morphologie interne d’un tubercule de pomme de terre. La séparation entre son caractère (P) et le parenchyme perimedullary (PM) est ornée de lignes noires. L’anneau vasculaire, qui sépare le parenchyme du cortex (C) est notée par une flèche noire. La fin de stolon (S) et des yeux de tubercule (E) est marqués ainsi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
3. jour 2 : Générer des protoplastes de pomme de terre
Remarque : Ceci doit être effectuée avec des outils stériles en milieu aseptique, comme une hotte à flux laminaire.
<ol><li>Préparer et filtrer (filtre de singes de 0,45 µm) une quantité appropriée de la Solution enzymatique (ES) (10 mL/échantillon) : 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, cellulase Onozuka R-10 4 %, 0,8 % macerozyme R-10, 1 % hemicululase, 10 tampon MES mM, pH 5,8. S’assurer que les filtres appropriés sont utilisés dans cette étape ; filtres avec des pores de taille inférieure à 0,45 µm sont tendance à encrasser alors qu’une membrane de liaison faible en protéines, comme les singes, minimise la perte de l’enzyme lors de la filtration.</li>
	<li>Aspirer hors PIS des échantillons dans les tubes coniques à l’aide d’une pipette stérile sérologique.</li>
	<li>Ajouter 10 mL d’ES pour chaque échantillon et inverser 2 à 3 fois.</li>
	<li>Incuber les échantillons durant la nuit à 29 ° C sous agitation horizontale 180 tr/min. Incuber les échantillons pendant au moins 16 h.</li>
</ol>4. jour 3 : Récolte de protoplastes et lavage des protoplastes
Remarque : Des conditions d’asepsie sont pas longtemps nécessaires à ce stade.
<ol><li>Prélèvement d’échantillons de shaker et leur permettre de se contenter de ~ 10 min.</li>
	<li>
Aspirer au large comme une grande partie de la solution ES que possible.
	<ol>
<li>Enlevez autant de la solution ES si c’est possible grâce à l’aide d’une pipette sérologique, en ayant soin d’éviter de retirer les tissus digérés.</li>
		<li>À l’aide d’une micropipette supprimer toute trace de solution ES, évitant à nouveau les tissus digérés. Cela se fait plus facilement en tenant le tube sous l’angle que la solution ES s’écoule vers le couvercle alors que les tissus digérés restent au fond.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 15 mL d’IPL pour chaque échantillon et inverser doucement 2 à 3 fois. Permettre aux protoplastes se contenter de 10 min.</li>
	<li>Enlever les PG avec une pipette sérologique. Utiliser une micropipette pour enlever n’importe quel liquide restant. Remarque : Cette étape est indispensable pour assurer l’intégrité des noyaux échantillon au cours de la cytométrie en flux. En dépannage, cette étape s’est avérée pour être la source la plus probable de l’échec dans un échantillon.</li>
</ol>5. jour 3 : Préparer les échantillons pour la cytométrie en flux
Remarque : L’échantillon devra être conservé sur la glace d’ici sauf indication contraire.
<ol><li>Préparer l’iodure de propidium (0,4 mg propidium iodure/mL FCB) et des solutions de RNase (0,8 mg RNase A / mL FCB) en dissolvant chacune de FCB. ATTENTION : L’iodure de Propidium est hautement toxique. Éviter tout contact avec la peau ou les yeux. Porter les EPI approprié.</li>
	<li>
Ajouter 1,5 mL de glace froide FCB pour chaque échantillon. Brièvement, shake ou vortex chaque échantillon pour briser agrégées des tissus. Il est important de briser les agrégats du tissu tuber afin que le FCB peut pleinement imprègnent les cellules et libérer les noyaux. Différents échantillons peuvent nécessiter plus ou moins agitation selon le tissu et le génotype. Remarque : Le FCB lyse des protoplastes, libérant les noyaux. D'où la nécessité du maintien de samples sur glace à prévenir la dégradation.<ol>
<li>Si le contrôle écoulement cytometry échantillons n’étaient pas comprises dans l’étape de génération de protoplaste ils peuvent être inclus ici. Si un contrôle doit être ajouté, hacher finement une petite feuille (~ 3 cm2) en 1,5 mL de glace froide FCB à l’aide d’une lame de rasoir. Échantillons de contrôle devraient être le même niveau de ploïdie que les échantillons expérimentaux, préférence le même génotype. Des plantules in vitro ont tendance à donner des pics plus propres qu’à effet de serre ou de plantes cultivées au champ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passer 1 mL de la suspension FCB/tissu à travers un filtre à tamis 106 µm. Utiliser un tube de microtubes de 1,5 mL avec le bout coupé et maille en métal fondu vers le bas comme indiqué au point 1.5.1. Ce tube de microcentrifuge peut être imbriqué directement dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et l’échantillon passé directement à travers. Si vous utilisez une autre méthode de filtration, le filtrat soient collecté dans un Pétri glacée et ensuite transféré dans un tube de 2 mL. NOTE : parfois les agrégats restants et les débris cellulaires peuvent obstruer le filtre à tamis. Simplement taper dans ce cas, les deux tubes de microcentrifuge imbriqués quelques fois pour déloger les débris.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de la solution de RNase dans chaque échantillon. Inverser et incuber pendant 30 min à température ambiante (RT). Remarque : Cette étape vise à supprimer les RNA échantillons, entraînant moins de bruit au cours de la cytométrie en flux. Cependant, comme les noyaux sont de courte durée, chercheurs peuvent décider de diminuer le temps d’incubation ou jouer sur la glace si elles connaissent une dégradation sévère de leurs échantillons.</li>
	<li>Ajouter 125 µL de la solution d’iodure de propidium à chaque échantillon. Inverser et incuber sur glace pendant 30 min. NOTE : Échantillons devraient être utilisés pour cytométrie dès que possible dégradation résulte moins de 2 h, même sur la glace.</li>
</ol>6. jour 3 : Cytométrie en flux de noyaux de tubercule de pomme de terre
NOTE : Logiciels et exploitation cytomètre en flux variera selon l’instrument et le fabricant. Des instructions détaillées sur l’opération spécifique du cytomètre fournira dans le Guide utilisateur de l’instrument.
<ol><li>Créer deux parcelles de dot à l’aide d’une échelle logarithmique de dispersion avant vs diffusion latérale et de la diffusion latérale de propidium iodure (PI) vs. Également créer un histogramme avec PI sur l’axe des abscisses. Échelle logarithmique est nécessaire pour s’assurer que tous les événements sont accessibles à échelle comme noyaux peuvent différer considérablement de fluorescence.</li>
	<li>
Charger un tube échantillon de contrôle connus et régler la tension de sorte que tous les événements sont à l’échelle. Nous utilisons des tissus in vitro d’un génotype de l’échantillon. Si des échantillons de différentes ploïdies doivent être exécutés, un échantillon de contrôle pour chacun doit être inclus.
	<ol>
<li>Prendre note de la chaîne du pic 2C dans l’échantillon de contrôle. Les pics 2C des échantillons expérimentaux doivent se situer au même endroit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Charger un échantillon expérimental (tubercule) et à nouveau de s’assurer que tous les événements sont à l’échelle. Si des ajustements sont nécessaires, répéter étape 6.2 pour identifier le canal de C 2 pics.</li>
	<li>La porte manuellement les noyaux de protoplaste en utilisant le nuage vs PI de côté.</li>
	<li>Définir l’histogramme de PI pour n’afficher que la région de noyaux de protoplaste fermée.</li>
	<li>Recueillir le nombre désiré d’événements de chaque échantillon. Les chercheurs utilisent fréquemment des 10 000 événements dépendants pour cytométrie ; Cependant, nous utilisons 2 000 événements pour les échantillons de protoplaste tuber pour accueillir plus d’échantillons et des échantillons avec des concentrations faibles.</li>
	<li>Calculer EI de chaque échantillon des histogrammes de PI en utilisant la formule suivante : AE =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> Lorsque 4C est le pourcentage des noyaux qui sont 4C (représentant un rond simple d’endoréduplication), 8c est le pourcentage qui sont 8C et ainsi de suite. Voir la Figure 4 pour obtenir des exemples d’histogrammes et valeurs de C des pics.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le protocole présenté ci-après fournit aux chercheurs un moyen d’évaluer l’endoréduplication dans les tubercules de pomme de terre, dont cellulaires mis à jour le contenu et d’une augmentation des cellules taille apparemment empêchent autres préparations de cytométrie de flux. Le protocole se fonde sur la génération de protoplaste comme moyen de réduire le bruit et les débris tout en conservant l’intégrité nucléaire. Auparavant, chercheurs ont décrit les préparations similaires pour les échantillons de cytométrie en flux particulièrement récalcitrants mais aussi utilisé des protoplastes de tuber pour étudier une variété de sujets tels que la pathogénie19,20. Cependant, à notre connaissance, aucun ont associé l’utilisation de ces protoplastes tuber à écoulement cytometry afin d’étudier l’endoréduplication. En outre, nous avons constaté l’utilisation de protoplastes plus fiables que les préparations brutes typiques ainsi que la technique utilisée dans les deux seuls autres études visant à évaluer la tuber endoréduplication6,7. Ici, nous discutons les lacunes du protocole, les pièges potentiels dans sa préparation de l’exécution et l’échantillon et les résultats une expérience typique qu’il emploie.
Malgré l’utilité et la répétabilité du protocole tuber cytométrie en flux, il possède quelques faiblesses qui devraient être discutées. Pour commencer, le protocole est temps intensif, nécessitant deux incubations durant la nuit. En outre, le protocole exige certains réactifs coûteux, en particulier la cellulase et macerozyme. En outre, les préparatifs sont très sensibles au temps, dégradant en quelques heures, ce qui pourraient limiter le débit au sein d’une seule journée, surtout si vous désirez plusieurs événements. Enfin, le protocole, bien que fiable, est sensible aux erreurs dans la préparation de l’échantillon qui semblent causer des dommages aux noyaux et des résultats de qualité inférieures. Par exemple, la contamination microbienne peut se produire au cours des étapes génération plasmolyse et protoplaste (1 – 3,4) due à une mauvaise technique aseptique. Contamination de l’échantillon, tout en n’excluant pas toujours le succès d’un échantillon, semble diminuer considérablement la qualité des histogrammes obtenus, encore une fois probables due aux dommages causés aux noyaux.
Comme indiqué précédemment, les principaux inconvénients du protocole sont coûts, temps et sensibilité aux erreurs. Les chercheurs voudra prendre des mesures afin d’atténuer chacune d'entre elles. En ce qui concerne les coûts, les chercheurs qui ont l’intention d’appliquer le protocole de nombreux échantillons peuvent considérer modifiant la concentration de l’enzyme et/ou la durée de l’étape de digestion comme différents tissus et génotypes peuvent varier de réactivité. Cela inclut la possibilité de filtrer et recyclage de l'ES qui a été démontré antérieurement mais non employé ici21. En ce qui concerne le temps, dans notre observation, il est possible de se passer de la première incubation (l’étape de la plasmolyse) et toujours extraire des protoplastes ; Cependant, leur intégrité et leur abondance souffrira, qui influe négativement sur résultats. Pour réduire la détérioration des échantillons chercheurs peuvent considérer que certaines approches de cytométrie de flux impliquent l’utilisation de fixateurs (p. ex., formaldéhyde) pour préserver l' intégrité d’échantillon22. Cela peut être un moyen utile à la fois prévenir la détérioration et permettant un échantillon stockage plutôt que des protoplastes exaction et écoulement cytometry survenant le jour même, tel que présenté. Un autre moyen d’éviter la déperdition des noyaux peut être d’inclure un inhibiteur de la nucléase aux ES et/ou FBC ; alors que le 2-mercaptoéthanol n’effectué aucun changement notable au cours du développement, autres inhibiteurs n’ont pas été testés dans les présentes.
Dans notre observation, la seule étape la plus critique est étape 4.4, la suppression de toute solution de lavage plasmolyse avant l’ajout de la mémoire tampon la cytométrie en flux (FCB). Si même un petit volume (< 10 µL) reste, les échantillons sont beaucoup plus susceptibles d’être dégradés qui peut conduire à un échantillon de pauvre ou même échoué. Ceci est probablement dû à des impuretés dans la solution d’enzyme (p. ex. nucléases, protéases)23,24 , qui dégradent rapidement les noyaux au cours de la période d’incubation et l’heure entre les exemples d’exécution, même à faibles concentrations. Une autre considération importante est la durée des étapes de l’incubation PI et RNase. Tel que mentionné dans le protocole, les échantillons ne restent pas stables pendant plusieurs heures après exécution de l’ajout de la FCB pour chercheurs peuvent décider de réduire la durée de ces étapes pour accueillir plus d’échantillons ou longues cytométrie résultant de noyaux faibles concentrations. Ceci exige également le chercheur à considérer le compromis entre nombre d’événements par exemple et le nombre total d’échantillons à tourner ou à envisager l’utilisation de fixateurs tel que mentionné précédemment.
Différences entre les génotypes et les tissus
Pour fournir des résultats représentant du protocole, nous avons conçu deux expériences simples pour confirmer la variation rapportée antérieurement par le tissu et examiner l’influence de ploïdie et le génotype. Les résultats de l’expérience de tissu démontrent que le protocole donne des résultats reproductibles, tel que des tissus de moelle s’est avérée une fois de plus pour avoir l’IE plus élevé. Étonnamment le tissu de parenchyme, qui n’avait pas déjà été évalué, avait une valeur EI semblable à du tissu cortical et significativement plus faible que par son caractère. Cela était imprévu : cellules du parenchyme sont généralement plus gros que la moelle ou de cellules corticales, au moins à maturité. Une explication possible est que les tubercules (90 à 130 g) étaient trop immatures pour les cellules de parenchyme, qui constituent la majorité du volume de tubercule à l’échéance, d’avoir pleinement développé et ont atteint leur maximum de valeurs de C25. Ceci pourrait également expliquer pourquoi la dihaploïde (VT_SUP_19) et le double dihaploïde (VT_SUP_19 x 4) démontré EI significativement plus élevée que les tubercules supérieure CV ; alors que les tubercules d’égale grosseur environ ont été prélevées chaque génotype, la taille maximale des tubercules de VT_SUP_19 ou les tétraploïdes isogéniques est beaucoup plus petite que celle de l’ancêtre. Ainsi, il peut être qu’ils affichent EI plu simplement parce qu’ils étaient plus grands par rapport à leur taille maximale atteignable. Par ailleurs, la différence peut être une conséquence du complément génétique VT_SUP_19 a reçu de son ancêtre tétraploïde. Une autre possibilité est que la réduction génomique qui s’est produite sur l’extraction de la dihaploïde des tétraploïdes peut-être avoir démasqué allèles délétères résultant de l’effort à l’échelle de la plante, qui a également été montré pour contribuer à l’élévation AE26. Néanmoins, cela démontre que les chercheurs d’un examen attentif doivent employer lors de la sélection des tubercules et les tissus à utiliser pour la comparaison des valeurs de l’assurance-emploi, en particulier entre les génotypes.
Applications futures
Le protocole décrit dans cet article aux chercheurs un outil important pour la compréhension endoréduplication dans potato. Il peut laisser d’études entre les composantes génétiques et environnementales d’endoréduplication, l’évolution temporelle du développement à travers les tissus de tubercule et l’évaluation des variations naturelles. En fin de compte, endoréduplication peut rendre une cible prometteuse pour l’amélioration de la pomme de terre, une entreprise qui aura besoin d’un moyen fiable d’évaluation.

Endoréduplication est le processus par lequel une cellule renonce au cycle cellulaire typique et plutôt subit un parcours alternatif de développement consistant à coups répétés de la réplication de l’ADN sans division cellulaire. La cellule résultante aura augmenté ADN taille contenue et nucléaire qui semble jouer un rôle dans la régulation cellulaire, expansion et spécialisation. Généralement, une ronde d’endoréduplication (appelé un endocycle) et l’augmentation correspondante de la teneur en ADN est associé à plus grand volume de la cellule, une observation qui a précipité la théorie « karyoplasmic » qui augmente la teneur en ADN est nécessaire pour correctement réguler un plus grand, peut-être plus complexe, cellule1. Ce phénomène est fréquent chez les plantes supérieures, ayant été observés dans une gamme de tissus, y compris ceux avec structural/défensif (trichomes)2,3, nutritive (maïs endosperme)4,5et évier/stockage ( péricarpe de tomate ; 8 fonctions de tubercule de pomme de terre)6,7,. Dans les fruits, il a été suggéré qu’endoréduplication joue un rôle dans la facilitation de l’expansion rapide du péricarpe comme en témoigne la relation négative entre la période du développement9endoréduplication et fruits. Par exemple les cellules avec l’ADN contenu jusqu'à 512C (512 fois le génome haploïde) ont été observés chez la tomate péricarpe8. En outre Chevalier et coll. (2014) a démontré que modifications dans l’expression des gènes du cycle cellulaire peuvent conduire à l’augmentation des niveaux d’endoréduplication dans le péricarpe qui ensuite se traduit par le plus grand fruit10. Modification des gènes favorisant l’endoréduplication fournit donc une cible potentielle pour l’amélioration de la biomasse ou le rendement par le biais de la sélection végétale ou manipulation génétique. Toutefois, cette amélioration est subordonnée à une meilleure compréhension des causes et conséquences d’endoréduplication.
Endoréduplication est le plus souvent mesurée par cytométrie en flux, par lequel les noyaux, sortis en tissu brut préparation11, sont incubés avec un fluorophore de liaison à l’ADN, comme l’iodure de propidium12 (PI). Les échantillons filtrés sont ensuite transmis par le laser d’un cytomètre en flux où les longueurs d’onde de d’émission spécifiques pour le fluorophore peuvent être observées. L’intensité de la fluorescence dans chaque épreuve (c.-à-d., noyau) est directement corrélée avec la teneur en ADN de la particule. Ainsi, en comparant à une norme connue, le contenu en ADN relatif et absolu de cellules dans un échantillon donné peut être calculé. Indices d’endoréduplication (AE) sont déterminés en établissant le nombre moyen d’endocycles par cellule au sein d’un échantillon en observant le contenu en ADN cellulaire (valeur C) où 1C est la teneur en ADN d’une cellule haploïde (formule présentée à l’étape 6,7 du protocole). Par exemple, dans un organisme diploïde, le contenu de base ADN des cellules somatiques est 2C. Si un échantillon comporte peu de cellules avec 4C, correspondant à un seul tour d’endoréduplication, ou plus, il aurait une EI proche de 0 ; Toutefois, si presque toutes les cellules sont 4C l’AE serait environ 1. Cependant, comme plusieurs séries d’endoréduplication sont fréquentes chez les valeurs observées pour l’AE plantes plus élevés peut être beaucoup plus. Lors du calcul des indices d’endoréduplication peut être relativement simple, qu'elle exige que les abondances relatives des noyaux C-valeurs soit fiable vérifiée, qui s’oppose à certaines espèces et les tissus (y compris les tubercules de pomme de terre). Il est probable que les différences cellulaires anatomie, chimie ou paroi cellulaire composition13 provoquer ces échantillons d’être récalcitrant à la préparation typique utilisant une lame de rasoir pour libérer les noyaux directement dans les buffers appropriés qui sont couramment utilisés avec des tissus comme le péricarpe de la tomate, un modèle pour l’endoréduplication étudie8.
Dans la pomme de terre, l’examen d’endoréduplication dans le tubercule reste limitée à quelques études, peut-être dues en partie à un manque d’un protocole fiable comme les préparations brutes précitées donnent des résultats incohérents. Bien que ces approches fonctionnent bien pour les feuilles, que les échantillons de tubercules dégradation sévère et une abondance de bruit sous forme de débris, différenciation des pics composé de noyaux avec différentes valeurs de C presque impossibles de faire l’expérience. C’est peut-être en raison des différences dans la composition cellulaire et une profusion de débris cellulaires dans les cellules du tubercule (e.g. amyloplastes emmagasinant de l’amidon). Pour surmonter cet obstacle, nous avons récemment mis au point un protocole plus fiable pour l’obtention de pics distinguables en cytométrie de flux des tubercules de pomme de terre. La fréquence des cellules au sein de chaque pic peut ensuite servir pour le calcul des niveaux précis d’endoréduplication pour différents génotypes ou différents tissus qui composent un tubercule. Le protocole, qui emploie un antécédent mis à jour le protoplaste extraction méthode14,15 décrit précédemment écoulement cytometry11, ont montré des variations considérables au sein de la famille de pomme de terre, les cultivars et tissus16 . Nous présentons ici le protocole en détail en évaluant l’IE dans les contextes de ploïdie, tissu et la taille du tubercule.

<table><tbody><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td>(stérile)</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP (autopipeteur)</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>(stérile)</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger (1,5 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111558</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger (2 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td></td><td></td>111552</tr><tr><td>Unité de filtration sous vide (0,22 & micro ; m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>564-0020</td><td>(stérile)</td></tr><tr><td>Unité de filtration sous vide (0,45 & micro ; m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td>(stérile)</td></tr><tr><td>Cellulase « Onozuka R-10"</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Macerozyme « Onozuka R-10"</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Hemicellulase</td><td>Sigma</td><td>H2125</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Acros Organics</td><td>172590250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Produits biochimiques</td><td>194854</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium (hexahydraté)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (dihydraté)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Acros Organics</td><td>423922500</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263-0250</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium (monobasique, anhydre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Pour préparations de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td>Pour préparations de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Foreurs de liège avec poinçon</td><td>American Scientific</td><td>2093-02</td><td>Pour l’échantillonnage des tissus</td></tr> <tr>souhaités<td>Pince</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-31</td><td>Pour l’échafaudage des tissus souhaités</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-920B</td><td>Pour l’échafaudage des tissus souhaités</td></tr><tr><td>106 &micro ; m treillis en acier inoxydable ou autre séif de la même taille de pores</td><td>New Jersey Wire Mesh Co.</td><td></td><td>Contacter l’entreprise</td></tr></tbody></table>

mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés tuber

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoréduplication, la réplication du génome nucléaire de la cellule sans cytokinèse ultérieur, donne des cellules à teneur accrue en ADN et est associée à la spécialisation, de développement et d’augmentation de taille cellulaire. Chez les plantes, endoréduplication semble faciliter la croissance et l’expansion de certains tissus et organes. Parmi eux se trouve le tubercule de pomme de terre (Solanum tuberosum), qui subit une expansion considérable de cellulaire dans l’accomplissement de sa fonction de stockage des glucides. Ainsi, endoréduplication peut-être jouer un rôle important dans Comment les tubercules sont en mesure d’accueillir cette abondance de carbone. Toutefois, les débris cellulaires résultant de méthodes d’isolement nucléaire brut de tubercules, méthodes qui peuvent être utilisés efficacement avec des feuilles, s’oppose à l’estimation de l’indice d’endoréduplication tuber (AE). Cet article présente une technique d’évaluation de tuber endoréduplication grâce à l’isolement de protoplastes tout en démontrant les résultats représentatifs provenant de différents génotypes et compartimenté tissus tuber. Les principales limitations du protocole sont les frais de temps et réactif requis pour la préparation des échantillons ainsi que la durée de vie relativement courte des échantillons après la lyse des protoplastes. Tandis que le protocole est sensible à la variation de la technique, elle représente une amélioration par rapport aux méthodes traditionnelles de l’isolement nucléaire de ces grosses cellules spécialisées. Possibilités d’amélioration du protocole dont le recyclage d’enzyme, l’utilisation de fixateurs et d’autres modifications sont proposées.

Production des protoplastes
La génération des protoplastes est nécessaire pour atteindre les résultats de cytométrie en flux reproductible de tubercules de pomme de terre, la morphologie générale de qui est affichée à la Figure 1. Les chercheurs pourrait assurer les protoplastes de haute qualité ont été produits avant l’addition du PCF, en particulier dans le cas où le dépannage est requis. La majorité des protoplastes doit être sphérique avec saillies minimales (Figure 2) et peut-être être très différents en taille, ce qui est peut-être le reflet de différences dans l’assurance-emploi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Figure 2 : représentant protoplastes foliaires et des tubercules, acquis à l’étape 4.4 du protocole. Protoplastes isolés doivent être sphérique et symétrique avec membrane plasmique intacte. Notez la différence de taille entre les feuilles (A-C) et les protoplastes de tubercule (D, E) ainsi que les différences de taille au sein d’un tissu pouvant indiquer différents niveaux d’endoréduplication. Protoplastes feuilles contiennent des chloroplastes tandis que les amyloplastes sont visibles dans les protoplastes de tuber. Barreaux de l’échelle = 1 000 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Évaluation des résultats de cytométrie en flux
Le succès ou l’échec d’une expérience peut être mesurée la largeur des pics et leur séparation dans les histogrammes de cytométrie de flux. Comme mesure endoréduplication exige de calculer l’abondance relative des noyaux dans chaque pic, simple présence ou absence de pics est insuffisante s’il y a trop de bruit d’établir des limites valables entre eux. La figure 3 affiche la variation dans les résultats, les chercheurs peuvent rencontrer dans les diagrammes de dispersion de cytométrie en flux et histogrammes. Les causes possibles pour les échantillons ayant échouées sont présentés dans la discussion.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Figure 3 : résultats représentatifs provenant de cytométrie en flux de noyaux de protoplastes d’intact et dégradé des échantillons de moelle. Noyaux intacts (A) montrent une séparation nette entre les pics de quantifier l’abondance relative des cellules dans chaque utilisant le logiciel approprié, alors que les sommets d’échantillons dégradés (B) montrent bases décalés, larges et qui se chevauchent. Dans les diagrammes de dispersion d’intact (C) et des échantillons (D) dégradés, boîtes noires indiquent des événements nucléaires, blocage des histogrammes et le regroupement des événements se reflète dans la largeur des pics histogramme. Les événements devant les portes indiquent des débris, noyaux gravement détériorés ou autres agrégats. PI-H correspond à l’intensité de la fluorescence, qui est mesurée en unités arbitraires. Méthodes de dépannage à prévenir la dégradation de l’échantillon sont discutées dans le texte. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Endoréduplication des différences entre les tissus
Nous avons rapporté précédemment que tuber moelle tissu a des niveaux significativement plus d’endoréduplication que cortex tissu16. Pour confirmer et étendre là-dessus nous regarda endoréduplication niveaux de trois tissus différents en cultivar supérieur : moelle, parenchyme perimedullary et cortex, reproduits en trois exemplaires, avec 2 000 événements fermées par exemple. Nos résultats confirment notre observation antérieure que par son caractère véritable tissu a EI significativement plus élevé que les tissus corticaux avec moyens de 1.79 et 1,12 endocycles par cellule, respectivement (p = 0,018 ; Du test t de Student). Étonnamment, le parenchyme a montré un profil similaire au cortex et était également significativement différente des tissus de la moelle (moyenne = 1,14 ; p = 0,013 ; Du test t de Student). Ces résultats sont résumés dans la Figure 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Figure 4 : endoréduplication dans trois tissus du cultivar supérieur. Histogrammes de feuilles (A), tuber cortex (B), parenchyme (C) et tissus de la moelle (D) sont indiquées ainsi que la valeur de l’AE, calculée à partir de ces histogrammes. Différences dans l’abondance relative des noyaux comprenant chaque pic sont facilement visible, surtout entre les tissus foliaires et des tubercules. C-valeurs pour chaque pic s’affichent également. PI-H correspond à l’intensité de la fluorescence, qui est mesurée en unités arbitraires. Moyenne des comparaisons de l’IE des tissus du tubercule sont affichent dans E où astérisque indique une différence significative (p &lt; 0,05) et les barres d’erreur Voir la déviation standard. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Influence de la taille du tubercule et ploïdie
Nous avons déjà indiqué que, pour un génotype donné, les tubercules de taille différente, mais la maturité similaire n’affichent pas une différence correspondante dans l’IE16. L’étude visait à confirmer ce résultat ainsi qu’évaluer la relation entre la ploïdie et endoréduplication. Pour cette expérience, nous avons utilisé trois répétitions du parenchyme de trois génotypes différents : cultivar supérieur (x 4), VT_SUP_19 (2 x) qui est une dihaploïde extraite de cultivar supérieur de prickle pollinisation17et VT_SUP_19 4 x qui est une dihaploïde doublé 18 isogéniques de VT_SUP_19. Nous avons inclus une série de répétitions pour grand (90 à 130 g) et petit (&lt; g 35) tubercules pour CV supérieur tandis que les tubercules pour les deux autres génotypes étaient de 90 à 130 g. Les tubercules ont tous étaient récoltés à partir de végétaux cultivés à pleine maturité, c'est-à-dire à effet de serre les sommets des plantes avaient sénescentes. Nous avons observé une différence significative entre VT_SUP_19 et son ancêtre supérieur (p = 0,04) ; Cependant, il n’y avait aucune différence significative entre VT_SUP_19 et VT_SUP_19 x 4 (p = 0,69). Ceci indique que bien qu’il y a une composante génétique susceptible d’endoréduplication, comme démasquée par la réduction de la génomique, il n’est pas dicté par ploïdie, au moins dans ce contexte. Enfin, nous avons une fois de plus n’observé aucune différence significative entre les grandes et petites CV tubercules supérieures comme le montre la Figure 5.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Figure 5 : endoréduplication dans deux tailles de tubercules de cultivar supérieur et ses diploïde (VT_Sup_19) et tétraploïdes (VT_Sup_19 x 4) dérivés. Le graphique montre la moyenne pour les petits (&lt; 35 g) et tubercules supérieure de la grande (90 à 130 g) CV comme tubercules gros (90 à 130 g) de la dihaploïde VT_SUP_19 et le dihaploïde doublé isogénique VT_SUP_19 x 4. Des différences significatives (p &lt; 0,05) sont indiqués par le rapport de lettre correspondance. Barres d’erreur représentent déviation standard. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Le protocole décrit ci-après est une méthode pour mesurer d’endoréduplication dans les tubercules de pomme de terre (Solanum tuberosum). Il comprend la plasmolyse et protoplaste étapes d’extraction pour diminuer le bruit et les débris en cytométrie en aval.

Mesurer d’endoréduplication par cytométrie de flux des protoplastes isolés Tuber

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer les niveaux d’endoréduplication dans les tubercules de pomme de terre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la morphologie des tubercules de pomme de terre, telles que le stade de développement au cours duquel les tissus des tubercules subissent une endoréduplication. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des résultats beaucoup plus clairs par rapport aux préparations typiques de cytométrie en flux.Parker Laimbeer fera la démonstration de la procédure. Un étudiant diplômé de mon laboratoire. Après avoir préparé les solutions et les tampons conformément au protocole textuel, stérilisez en surface les tubercules de pomme de terre en les immergeant dans de l’éthanol à 71 % pendant au moins cinq minutes.Retirez les matières végétales de l’éthanol et laissez-les sécher à l’air. Préparez et étiquetez des tubes coniques stériles de 50 millilitres pour chaque échantillon et aliquotez-y 15 millilitres de solution d’incubation de plasmolyse stérilisée avec filtre, ou PIS, dans chacun. À l’aide d’un scalpel stérilisé ou d’un liège, on a sondé un échantillon d’environ un centimètre cube du désir de stériliser les tissus.À l’aide du scalpel de stérilisation, coupez grossièrement le tissu en morceaux d’environ trois millimètres cubes. Et transférez le tissu dans un tube conique contenant du PIS. Ensuite, incubez le tissu à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Pour générer des protoplastes de pomme de terre, commencez par préparer et filtrer une quantité appropriée de solution enzymatique ou ES avec 0,71 molaire de mannitol, trois millimolaires de chlorure de calcium, un millimolaire de phosphate monopotassique. Un millimolaire de chlorure de magnésium, 4 % de cellulase Onozuka R-10, 0,8 % de macérozyme R-10, 1 % d’hemi cellulase et 10 millimolaires de tampon MES, pH 5,8. À l’aide d’une pipette sérologique, aspirer le PIS des échantillons dans les tubes.Ajoutez 10 millilitres de ES à chaque échantillon et retournez les tubes deux à trois fois. Ensuite, incubez les échantillons à 29 % Celsius et 180 tr/min pendant la nuit. Le troisième jour, pour récolter et laver les protoplastes, retirez les échantillons de l’agitateur et laissez-les reposer pendant environ 10 minutes.À l’aide d’une pipette sérologique, aspirez la plus grande partie possible de la solution ES, en prenant soin d’éviter les tissus digérés. Ensuite, à l’aide d’une micro-pipette et tout en tenant le tube en biais, retirez à nouveau toute solution ES restante en évitant le tissu digéré. Il est essentiel d’éliminer autant que possible la solution de lavage des protoplastes pour éviter d’endommager les noyaux.Tenir le tube à un angle peut aider à l’élimination de la solution tout en laissant les protoplastes. Ajoutez 15 millilitres de PWS à chaque échantillon. Et retournez doucement le tube deux à trois fois.Laissez les protoplastes se déposer pendant 10 minutes. Utilisez ensuite une pipette sérologique pour retirer le PWS. Et une micro pipette pour retirer le liquide restant.Tout en gardant les échantillons sur de la glace, ajoutez 1,5 millilitre de FCB glacé dans chaque tube. Secouez brièvement ou agitez chaque échantillon pour briser les tissus agrégés. Il est important de briser les amas de tissu du tubercule afin que le FCB puisse pénétrer complètement dans les cellules et libérer les noyaux.Si un témoin doit être ajouté, à partir de cette étape, utilisez une lame de rasoir pour hacher finement une petite feuille dans 1,5 millilitre de FCB glacé. Les échantillons de contrôle doivent avoir la même ploité que les échantillons expérimentaux, de préférence le même génotype. Insérez un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec l’embout coupé et un treillis métallique de 106 micromètres fondu au fond dans un tube de micro-centrifugeuse de deux millilitres.Passez ensuite un millilitre de suspension tissulaire FCB à travers le filtre. Ajoutez 250 microlitres de solution d’ARN à chaque échantillon. Ensuite, retournez les tubes et incubez-les pendant 30 minutes à température ambiante.Ajoutez 125 microlitres d’iodure de propidium ou de solution de PI préalablement préparée à chaque échantillon. Retournez et incubez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes. Utilisez les échantillons dès que possible et dans les deux heures pour éviter la dégradation.Créez deux diagrammes à points à l’aide de l’échelle logarithmique de la diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale et de l’IP par rapport à la diffusion latérale. Créez également un histogramme avec PI sur l’axe des x. Une échelle logarithmique est nécessaire pour s’assurer que tous les événements sont à l’échelle, car les noyaux peuvent différer considérablement en fluorescence.Chargez un tube d’un échantillon de contrôle connu, tel qu’un tissu foliaire in vitro, à partir d’un génotype d’échantillon. Et ajustez la tension pour que tous les événements soient à l’échelle. Notez le canal du pic 2C dans l’échantillon de contrôle.Les pics 2C des échantillons expérimentaux doivent se situer au même endroit. Chargez un échantillon de tubercule expérimental et assurez-vous à nouveau que tous les événements sont à l’échelle. Si des ajustements sont nécessaires, répétez le réglage de la tension de l’échantillon de contrôle pour identifier le canal des crêtes 2C.Gate manuellement les noyaux de protoplastes à l’aide du graphique de diffusion latérale en fonction de PI. Réglez ensuite l’histogramme PI pour qu’il n’affiche que la région des noyaux de protoplaste contrôlée. Collectez le nombre d’événements souhaité à partir de chaque échantillon.Les chercheurs utilisent fréquemment 10 000 événements déclenchés pour la cytométrie en flux. Cependant, les événements 2000 sont utilisés ici pour les échantillons de protoplastes de tubercules afin d’accueillir plus d’échantillons et d’échantillons à faible concentration. La génération de protoplastes est nécessaire pour obtenir des résultats de cytométrie en flux reproductibles à partir de tubercules de pomme de terre.La morphologie générale est affichée ici. La séparation entre le parenchyme moelleux et le parenchyme périmédullaire est illustrée par des lignes noires. L’anneau vasculaire, qui sépare le parenchyme du cortex, est indiqué par une flèche noire.Les protoplastes isolés doivent être sphériques et symétriques avec la membrane plasmique intacte. Notez la différence de taille entre les protoplastes des feuilles et des tubercules, ainsi que les différences de taille à l’intérieur d’un tissu, ce qui peut indiquer différents niveaux d’endoréduplication. Cette figure montre la variation des résultats qui peut être rencontrée à la fois dans les nuages de points et les histogrammes de cytométrie en flux.Les noyaux intacts montrent une séparation nette entre les pics pour quantifier l’abondance relative des cellules, tandis que les échantillons intégrés de pics montrent des bases larges et décalées et chevauchantes. Dans les nuages de points correspondants, les cases noires indiquent le déclenchement des événements nucléaires pour les histogrammes, et le regroupement des événements est reflété dans la largeur des pics de l’histogramme. Cette expérience analysant les niveaux d’endoréduplication ou EI confirme les résultats précédents selon lesquels le tissu de la moelle présente une EI plus élevée que le tissu du cortex.Étonnamment, le profil du tissu du parenchyme était similaire à celui du cortex et était également significativement différent du tissu de la moelle. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la stérilité de l’échantillon pour les deux premières incubations ainsi que de garder les échantillons sur de la glace autant que possible après que les protoplastes ont été lysés. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la manipulation génétique peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme quels gènes influencent les niveaux d’endoréduplication des tubercules.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les protoplastes des tubercules de pomme de terre et de les préparer pour la cytométrie en flux afin d’étudier leurs niveaux d’endoréduplication. N’oubliez pas que travailler avec de l’iodure de propidium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles qu’un EPI approprié doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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