Name: 초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 학습하세요 Drosophila 애벌레의 후각 신경 optogenetic 자극에 따른 행동 반응 분석 방법입니다. 630nm 파장의 빛을 이용해 특정 후각 수용 신경을 활성화하고 애벌레의 이동 행동을 정밀하게 추적합니다.

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이 작품은 네바다, Reno의 대학에서에서 시작 자금 및 NIGMS 부여 번호 P20 GM103650 건강의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.

1. 동작 경기장 건물과 행동 분야에서 Optogenetic 자극 수 있도록 하드웨어 준비
<ol><li>빛을 박탈 행동 경기장을 구축, 66 cm3 x 61 x 89의 차원으로 상자를 만들 (35"L x 24" W x 26"H) 블랙 컬러 플 렉 시 글라스 아크릴 시트 (두께 3 m m) ( 재료의 표참조)의 만든. 이러한 상자를 만들려고 재료 로컬 하드웨어 매장에서 사용할 수 있어야. (그림 1A) 동작 방에 테이블 탑에이 상자를 배치 합니다.</li>
	<li>흑백 USB 3.0 CCD 카메라는 IR 긴 통과 830 nm 필터와 8 m m F1.4 C 마운트 렌즈를 장착 하는 마운트 ( 재료의 표참조) 블랙 박스 천장의 센터에. 장소 2 개의 적외선 LED 스트립 ( 재료의 표참조) 테이블 위에 어두운 경기장 (그림 1A)에서 애벌레를 조명 하기 위하여.</li>
	<li>LED 플랫폼 구축, 22 c m × 22 c m 평방 알루미늄 접시 (선호 그린 매트 블랙으로 마무리 한 반사를 제거 하는 스프레이)를 얻을. 격판덮개의 센터에서 CCD 카메라 주위에 맞게 충분히 큰 구멍을 뚫고 금속 커터를 사용 하 여.</li>
	<li>빨간색 LED 스트립 조명 ( 재료의 표참조)와 금속 플레이트 커버. 시리즈에서 LED 빛 스트립 와이어 솔더와 라즈베리 파이 2B 마이크로프로세서에 의해 제어 되는 커플러 릴레이에 스트립 와이어 피드 ( 재료의 표참조) (그림 1B 와 2).</li>
	<li>설치 하 고 LED 스트립 광 커플러 릴레이 연결 하기 전에 라즈베리 파이 프로세서에 우분투 친구/Raspian 제시/리눅스 기반의 운영 체제를 구성 합니다. 전원 공급 장치 LED 스트립 및 커플러 (그림 2)를 연결 ( 재료의 표참조). (그림 1B) CCD 카메라는 LED 플랫폼을 탑재 합니다. 참고: 우분투 메이 트 v16.04 운영 체제는 자유롭게 사용할 수 있습니다. 간단한 파이썬 기반 명령 집합 LED 가벼운 자극 (구문 파일 참조)의 프로그램 패턴을 쉽게 적용할 수 있습니다.</li>
	<li>행동 분야에서 여러 지점에서 동질적인 irradiance를 확인 합니다. 계의 도움으로 경기장의 표면에 절대 방사를 측정 하 고 경기장의 표면에 걸쳐 ~1.3 W/m2 로 그것을 결정 합니다. 참고:이 강도에서 더 중대 한 변화에서에서 관찰 되었다 온도 실험의 과정을 통해. 또 다른 연구10 ~1.9 W/m2 의 높은 방사를 사용 하 고 실험의 과정을 통해 온도에 아무런 변화를 관찰.</li>
</ol>2. 동작 분석 초파리 애벌레의 준비
<ol><li>표준 비행 거리 음식에 파리를 유지 ( 재료의 표참조) 25 ° C, 50-60 %RH, 그리고 12 h/12 h 명암 주기에서.</li>
	<li>
한 쌍의 ORNs에서 CsChrimson 을 표현 하기 위하여 처녀 여성에서에서 교차 UAS-벨트-CsChrimson 선 OrX Gal4 선에서 남성 (21 애벌레 냄새 수용 체 중 하나에 해당 하는 'X' (또는) 각 고유 하 게 표현 되는 유전자 ORNs의 21 쌍)의9,11.
	<ol>
<li>또는, 모든 21 애벌레 ORNs에서 CsChrimson 을 표현 하기 위하여 UAS-벨트-CsChrimson 에서 처녀 여성 크로스 라인 남성에 게는 Orco Gal4 선 ('Orco'는 모든 21 ORNs에 표현 되는 공동 수용 체)에서.</li>
		<li>이 실험에서 컨트롤로 자체로 UAS-벨트-CsChrimson 라인을 사용 합니다. 참고: 여기에 나열 된 비행 주식 모두에서 사용할 수 있습니다 블루밍턴 초파리 재고 센터 ( 재료의 표참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
십자가에서 남성과 여성의 파리 친구 및 48 h에 대 한 알 수 있습니다, 일단 성인 신선한 유리병에 전송.
	<ol>
<li>계란을 포함 하는 식품 유리병의 표면에 400 µ M, 모든 trans 망막 (ATR) 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 용 해 및 89 m m 자당 증류수에 용 해를 포함 하는 혼합물의 400 µ L를 추가 합니다. 참고: 작은 양의 자당 ATR 솔루션의 애벌레 먹이 촉진 합니다. ATR은 CsChrimson 식9,10upregulating에 필요한 공동 인자 이다. ATR은 빛에 민감한.</li>
		<li>ATR 계란을 포함 하는 음식 튜브에 추가 되 면 추가 72 h에 대 한 어둠 속에서 튜브를 품 어. 참고:이 연구 및 위의 두 연구 ATR 먹이 인 애벌레 행동에 효과 관찰 하지, 하는 동안 제어 ATR ATR를 포함 하지 않는 위의 혼합물의 동일한 금액을 테스트 라인을 쓰는 하 여 먹이의 효과 대 한 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>높은 밀도 (15%) 자당 솔루션을 사용 하 여 부유 하 여 제 3 탈피 애벌레 (달걀 누워 후 ~ 120 h) 비행 식품의 표면에서 추출. 한 P1000 사용 micropipette 1000 mL 유리 비 커에 자당 솔루션의 표면에 떠 있는 애벌레를 구분 합니다.</li>
	<li>워시 애벌레 때마다 유리 비 커에 800 mL 신선한 증류수를 교환 하 여 3-4 회. 애벌레 동작 분석 결과를 그들을 복종 하기 전에 10 분 동안 휴식을 하실 수 있습니다.</li>
</ol>3. 동작 분석 결과
<ol><li>(22-25 ° C) 사이 일관 된 온도 유지 및 동작 방에 습도 (50와 60 %RH) 사이.</li>
	<li>
22 cm x 22 cm 광장 페 트리 접시에 녹은 agarose (1.5%)의 따르는 150 mL로 애벌레 크롤링 매체를 준비 합니다. 1 페 트리 접시의 분석 결과, 실험 당 8-10 시험의 각 재판 부 어 있다. 응고 및 동작 분석 결과에서 그들을 사용 하기 전에 접시에 1-2 시간 기다린 agarose를 허용 합니다.
	<ol>
<li>전송 준비 3-탈피 애벌레의 20 개 이상 하는 센터의 페 트리 접시 (그림 1C). 페 트리 접시의 뚜껑을 커버. CCD 카메라 아래 행동 분야에서 페 트리 접시를 놓습니다. 참고: 실험에 따라 동작 분석 실험 일반적으로 수행 됩니다 3-5 분. odorant 지도 단서를 제공 하는 분석 결과에 사용 되 면 그것은 관찰 되었다 결과 냄새 그라데이션 약 5 분의1에 대 한 안정적인 유지. 긴 시험 시간은 권장 하지 않습니다. 탈수 또는 장기간된 630 nm 빨간불을 노출에서 애벌레에 해로운 효과 하지이 시간 포인트 내에서 관찰 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>설정에 850 nm 적외선 LED 가벼운 소스 동영상에 애벌레를 시각화. 애벌레 움직임을 기록 하는 CCD 카메라를 시작 합니다.</li>
	<li>라즈베리 파이 프로세서, 프로그램 레드 빛 자극의 적절 한 패턴을 관리 하는 절차와 관련 된 소프트웨어를 사용 하 여. 참고: 일련의 간단한 파이썬 기반 명령 (구문 파일 참조) LED 가벼운 자극의 프로그램 패턴을 쉽게 적용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 데이터 처리 및 분석
<ol><li>Matlab 같은 모든 사용 가능한 프로그래밍 소프트웨어에 각 재판의 녹화 된 비디오를 가져옵니다.</li>
	<li>시간의 기능으로 동영상에 있는 모든 애벌레의 XY 좌표를 가져옵니다. 추적 소프트웨어의 한계에 따라 15-20 제 3 탈피 애벌레 단일 영화1,8에서 추적할 수 있습니다. 참고: 세트 (구문 파일 참조) 적절 한 조건에 맞게 쉽게 적응 될 수 있는 간단한 Matlab 코드 ('Tracklarva')이 제공 됩니다. 이 실험에서 모든 시험을 결합 하 여 프로그램과 분석 결과의 전체 기간에 대 한 모든 유 충의 XY 좌표를 출력 (아래 코드 구문 참조). 또는, 한 연구자에 자유롭게 사용할 수 있는 여러 가지 오픈 소스 기반된 프로그램을 사용할 수 있습니다. 예: JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
생성 된 XY 좌표를 사용 하 여 애벌레 궤적 플롯을 추가 애벌레 운동 분석.
	<ol>
<li>행동 분석에 대 한 시퀀스 실행의 교류로 개별 애벌레 궤적 세그먼트 속도, 경로 곡률, 제목 각도, 탐색 통계를 사용 합니다.</li>
		<li>실행은 앞으로 운동의 연속 기간으로 정의 됩니다. 회전 연속 실행을 구분합니다. 궤적 방향 각도 변경 했다 회전 표시 > 45 ° (구문 파일 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>필요에 따라 길이, 실행된 방향 및 다른 매개 변수를 실행 하는 실행된 속도 대 한 평균 값을 계산 합니다. 참고: 애벌레 궤도에서 '실행' 하 고 '중지'를 추출 하는 간단한 구문 집합이 제공 됩니다 (구문 파일 참조). 간단한 Matlab 또는 Excel 기반된 함수 '실행된 속도'에 대 한 값을 계산 실행' 길이'를 추출 된 데이터에 적용할 수 있는 등.</li>
	<li>± SEM. 의미 각 행동 메트릭에 대 한 데이터를 나타내는</li>
</ol>

<ol><li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li>
<li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li>
<li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular%2C+anatomical%2C+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li>
<li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li>
<li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li>
<li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li>
<li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24509633">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAABA%3A+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li>
<li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li>
<li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li>
<li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li>
<li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리가 초파리 애벌레 동작 동시 optogenetic 후 각 뉴런의 활성화에 대 한 응답에서의 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법1,를 추적 애벌레8 기술을 사용 하 여 다른 냄새 배달 ORNs를 활성화. 그러나, 이러한 방법은 특이성 또는 온 활성화의 시간적 패턴에 대해 제어할 수 없습니다. 우리의 방법은 온 활성화의 더 정밀 하 게 제어 냄새 자극 대신 가벼운 자극을 사용 하 여 이러한 적자를 극복 했다.
동작 경기장을 빌드하는 데 필요한 자료 지역 철물점에서 쉽게 구할 수 있습니다 하 고 어셈블리에서 최소의 노력을 요구 한다. Optogenetics 모듈을 준비 하는 데 필요한 전자도 쉽게 사용 가능 하 고 생성 된 있습니다. 설명 하는 방법을 여기를 사용 하 여 빨간 불 채널 레드 이동 rhodopsin 활성화 (C...

초파리 애벌레의 환경에서 후 각 정보는 궁극적으로 애벌레 동작1,2,3,4결정만 21 기능적으로 뚜렷한 ORNs, 활동에 의해 감지입니다. 그러나, 상대적으로 작은 논리는 감각 정보를 인코딩하는이 21 ORNs의 활동에 대 한 알려져 있다. 따라서 실험적으로 측정 하는 동작을 각 애벌레 ORN의 기능적 기여 필요가 있다.
하지만 초파리 애벌레 ORNs의 전체 레 퍼 토리의 감각 응답 프로필 세부1,,45, 후 각 회로 하 고 그로 인하여 개별 ORNs의 기여에서에서 공부 하고있다 탐색 동작 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 애벌레 행동 연구에 어려움 공간 및 일시적으로 활성화 한 ORNs 하는 무 능력 때문에 지금까지 발생 한다. 특히 21 초파리 애벌레 ORNs의 19를 활성화 하는 odorants의 패널이 했다 최근 설명된1. 낮은 농도에서 패널에서 각 odorant 그것의 동족 온 에서만에서 생리 응답 elicits. 그러나, 기존의 행동 분석에 일반적으로 사용 되는 높은 농도에서 각 odorant 여러 ORNs1,,56생리 응답 elicits. 또한,이 패널에서 odorants volatilities 안정적인 냄새 그라디언트7,8의 형성에 의존 하는 행동 연구의 해석을 복잡 하 게 하는 다양 한 있다. 마지막으로, 자연스럽 게 발생 냄새 자극 실험실 조건 하에서 복제 하기 어려운 일시적인 구성 요소가 있다. 그것은 따라서 동시에 공간 및 시간적으로 개별 ORNs를 활성화 하는 동안 애벌레 동작을 측정할 수 있는 방법을 개발 하는 것이 중요.
여기, 우리는 앞에서 설명한 애벌레 추적 이점이 메서드 분석 실험1,8보여 줍니다. Gershow 외 에 설명 된 추적 분석 결과 동작 경기장8에서 냄새의 안정 그라디언트를 유지 하기 위해 전자 제어 밸브를 사용 합니다. 그러나, 냄새 자극 설정 구축에 관련 된 복잡 한 엔지니어링의 수준 때문에이 메서드는 다른 실험실에서 복제 어렵다. 또한, 특히 단일 ORNs를 활성화 하기 위해 odorants를 사용 하 여 관련 문제는 해결 되지 않은 남아 있습니다. 매튜 외 에 설명 된 추적 분석 결과 간단 하 게 냄새 배달 시스템을 사용 하지만 결과 냄새 그라데이션 테스트 odorant의 변동에 따라 달라 집니다1분석 결과 긴 기간에 대 한 안정적입니다. 따라서, 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여 우리의 방법은 특이성의 장점과 온 활성화의 정확한 시간 제어 하 고 다른 힘의 기온 변화도 냄새의 형성에 종속 되지 않습니다.
우리의 방법은 쉽게 설정 이며 연구자 초파리 애벌레 탐색의 측면을 측정 하는 데 관심이 대 한 적절 한입니다. 이 기술은 연구원은 드라이브 선택의 그들의 마음에 드는 시스템의 neuron(s)에서 CsChrimson 의 식 수는 다른 모델 시스템에 적응 될 수 있습니다. CsChrimson 채널 rhodopsin의 빨간색 이동 버전입니다. 그것은 애벌레의 phototaxis 시스템에 표시 되지 않는 파장에서 활성화 됩니다. 따라서 특이성, 안정성 및 재현성9뉴런의 활동을 조작할 수 있습니다. 계정 과목의 크기 변화에 대 한 소프트웨어를 작성 하는 사용자 정의 수정 하 여이 방법을 쉽게 다른 곤충 종의 크롤링 애벌레에 맞게 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td><유충의 움직임을 포착하는 strong>비디오 카메라</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>106215</td><td></td></tr><tr><td>M52에서 M55 필터 스레드 어댑터</td><td>Edmund Optics</td><td>59-446</td><td></td></tr><tr><td>이미징 렌즈용 2" 스퀘어 스레드 필터 홀더&nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>59-445</td><td></td></tr><tr><td>RG-715, 2" Sq. 롱패스 필터</td><td>Edmund Optics</td><td>46-066</td><td></td></tr><tr><td>Electronics, for optogenetic setup</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raspberry Pi 2B</td><td></td><td>RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2</td><td></td></tr><tr><td>3 채널 프로그래밍 가능 전원 공급 장치</td><td>newegg.com</td><td>9SIA3C62037092</td><td></td></tr><tr><td>8 채널 광커플러 릴레이</td><td>amazon.com</td><td>6454319</td><td></td></tr><tr><td>630nm 쿼드 로우 LED 스트립 조명</td><td></td><td>environmentallights.com red3528-450-reel</td><td></td></tr><tr><td>850nm LED 스트립</td><td>environmentallights.com</td><td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td><td></td></tr><tr><td>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>매쓰웍</td>스<td></td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu MATE v16.04</td><td>Nubuntu</td><td>https://github.com/yslo/nubuntu</td><td></td></tr><tr><td>기타 항목</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>플렉시 유리 블랙 아크릴</td><td>Home Depot</td><td>MC1184848bl</td><td></td></tr><tr><td>Fly food and other reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrifly fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 파우더</td><td>제네시 사이언티픽</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>22cm X 22cm 사각 페트리 접시</td><td>VWR Inc.</td><td>25382-327</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>모든 트랜스-레티날</td><td>시그마-알드리치</td><td>R2500</td><td></td></tr><tr><td>Flies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-IVS-CsChrimson&nbsp; </td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55134</td><td></td></tr><tr><td>Orco-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>Or42a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9970</td><td></td></tr><tr><td>Or7a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>23907</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리 애벌레 동작 optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

냄새 소스 쪽으로 이동 하는 곤충의 능력은 그들의 1 차 후 각 수용 체 신경 (ORNs)의 활동을 기반으로 합니다. Odorants 온 응답에 대 한 상당한 양의 정보를 생성 하는 동안 운전 행동 응답에 특정 ORNs의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 개별 ORNs, 여러 ORNs 단일 odorants, 그리고 어려움을 자연스럽 게 관찰된 시간적 변화 후 각 자극을 사용 하 여 복제에 의해 활성화 활성화 하는 odorants의 다른 volatilities 인해 발생 하는 동작 분석에 합병증 실험실에서 기존의 냄새 배달 방법입니다. 여기, 우리는 분석 초파리 애벌레 동작의 ORNs의 동시 optogenetic 자극에 응답에서 하는 프로토콜을 설명 합니다. 여기에 사용 된 optogenetic 기술 ORN 활성화의 특이성 ORN 활성화의 시간적 패턴의 정밀 하 게 제어 가능 합니다. 해당 애벌레 움직임 추적, 디지털 기록, 및 사용자 정의 작성 된 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여이 메서드 애벌레 행동에 미치는 영향을 연구 하기 위해 개별 ORN 활성화 더 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 우리의 방법은 애벌레 행동에 로컬 뉴런 (LNs) 뿐만 아니라 2 차 프로젝션 뉴런 (PNs)의 영향을 공부 더 연장 될 수 있습니다. 이 방법은 따라서 후 각 회로 기능의 포괄적인 절 개 하면 그리고 어떻게 후 각 신경 활동에 대 한 보완 연구에 행동 반응 번역.

ORN 활성화의 특이성을 보여 우리의 방법 성공적으로 두 다른 온 (ORN::7a &amp; ORN::42a)의 영향을 결정 하기 위해 적용 된 애벌레 동작 (그림 3)에 (ORNs Or7a 또는 Or42a을 표현) 활성화. 최근 연구는 개별 일치 애벌레 ORNs 기능적으로 뚜렷한1,10,13, 우리의 대표적인 데이터 표현 CsChrimson ORN::7a 빛에 의해 자극 되었다 때 했음을 보여 줍니다 한 실행 길이 제어 동물에 비해 상당한 감소. 반대로, CsChrimson을 표현 하는 ORN::42a는 빛에 의해 자극 했다 때 있었다 크게 증가 제어 동물 (그림 3)에 비해 실행된 길이에. 집단 ...

이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

이 방법론의 전반적인 목표는 후각 뉴런의 광유전학적 자극에 대한 반응으로 초파리 유충의 탐색 행동을 분석하는 것입니다. 이 방법은 후각 회로 기능을 포괄적으로 해부할 수 있게 하고 후각 회로 기능이 행동 반응으로 어떻게 변환되는지에 대한 연구를 보완합니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 후각 뉴런을 활성화하기 위해 전통적인 냄새 구배 대신 빛을 사용하여 특이성과 시간 제어입니다.실험을 시작하려면 조명이 부족한 행동 경기장을 만드십시오. 89 x 61 x 66cm 크기의 상자를 3mm 두께의 검은색 플렉시글라스 아크릴 시트로 만듭니다. 행동실의 탁자 위에 상자를 놓습니다.다음으로, IR Longpass 830 나노미터 필터와 8mm F1.4 C 마운트 렌즈가 장착된 흑백 USB 3.0 CCD 카메라를 블랙박스 천장 중앙에 장착합니다. 탁자에 두 개의 적외선 LED 스트립을 놓아 어두운 경기장의 유충을 비춥니다. 그런 다음 22cm x 22cm 정사각형 알루미늄 판을 가져와 LED 플랫폼을 구축합니다.플레이트 중앙에서 금속 절단기를 사용하여 CCD 카메라 주위에 들어갈 만큼 충분히 큰 구멍을 자릅니다. 금속판을 빨간색 LED 스트립 조명으로 덮습니다. LED 조명 스트립 와이어를 직렬로 납땜하고 스트립 와이어를 Raspberry Pi 2B 마이크로프로세서에 의해 제어되는 광커플러 릴레이에 공급합니다.그런 다음 CCD 카메라 주위에 LED 플랫폼을 장착합니다. 그런 다음 광 커플러 릴레이를 LED 스트립에 연결하기 전에 Raspberry Pi 프로세서에 Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux 기반 운영 체제를 설치하고 구성합니다. LED 스트립과 광커플러에 전원을 공급하기 위한 전원 공급 장치를 연결합니다.행동 영역에서 CCD 카메라 주변의 다양한 지점에 균일한 방사 조도가 있는지 확인합니다. 분광계의 도움으로 경기장 표면의 절대 방사 조도를 확인하고 경기장 표면 전체에 걸쳐 미터당 약 1.3와트의 제곱으로 결정합니다. 표준 플라이 사료에 먹인 파리를 섭씨 25도, 상대 습도 50-60%에서 12시간, 12시간 명/암 주기로 유지합니다.CsChrimson을 한 쌍의 ORN으로 표현하려면 UAS-IVS-CsChrimson 라인의 처녀 암컷을 ORX-GAL4 라인의 수컷으로 교차시킵니다. 교배된 수컷과 암컷 파리가 48시간 동안 짝짓기를 하고 알을 낳도록 한 후, 성충을 새 유리병으로 옮깁니다. 계란이 들어 있는 식품 바이알의 표면에 증류수에 용해된 89밀리몰 자당에 디메틸 설폭사이드 또는 DMSO에 용해된 400마이크로몰의 모든 트랜스 레망날(ATR)을 포함하는 혼합물 400마이크로리터를 추가합니다.계란이 들어 있는 식품 바이알에 ATR을 넣으면 어둠 속에서 바이알을 추가로 72시간 동안 배양합니다. 배양 후, 고밀도 15% 자당 용액을 사용하여 파리 먹이 표면에서 세 번째 인스타 유충을 추출합니다. P1000 마이크로 피펫을 사용하여 자당 용액 표면에 떠 있는 유충을 1, 000밀리리터 유리 비커로 분리합니다.유리 비커에 800ml의 신선한 증류수를 교환하여 유충을 네 번 씻습니다. 최종 세척 후 유충을 10분 동안 쉬게 한 후 행동 분석을 실시합니다. 거동 분석을 위해 행동실에서 일정한 온도와 습도를 유지하십시오.22cm x 22cm 정사각형 페트리 접시에 녹은 1.5% 아가로스 150ml를 부어 유충 크롤링 배지를 준비합니다. 아가로스를 굳히고 페트리 접시에서 1-2시간 동안 식힌 후 행동 분석에 사용하십시오. 아가로스가 굳은 후, 준비된 세 번째 인스타 유충 중 20마리 이하를 페트리 접시의 중앙으로 옮기고 페트리 접시를 뚜껑으로 덮습니다.CCD 카메라 아래의 행동 경기장에 페트리 접시를 놓습니다. 850나노미터 적외선 LED 광원을 켜서 비디오에서 유충을 시각화합니다. CCD 카메라를 시작하여 애벌레의 움직임을 기록합니다.마지막으로 데이터 처리 및 분석으로 이동합니다. CsChrimson을 발현하는 ORN 7a가 빛에 의해 자극되었을 때, 대조 동물에 비해 실행 길이가 현저히 감소했습니다. 반대로, CsChrimson을 발현하는 ORN 42a가 빛에 의해 자극되었을 때, 대조 동물에 비해 실행 길이가 유의하게 증가하였다.우리는 ORN 42a의 경우 광 자극의 다양한 시간적 패턴이 다른 행동 반응을 이끌어낸다는 것을 발견했습니다. 우리는 1차 후각 수용체 뉴런에 대해 이 방법을 입증했지만, 우리의 방법은 또한 투영 뉴런 및 국소 뉴런과 같은 다운스트림 뉴런이 애벌레 행동에 미치는 영향을 측정하는 것과 같은 다양한 미래 응용 분야를 허용합니다. 우리는 이 기술이 유충의 후각 회로 기능을 포괄적으로 해부할 수 있는 길을 열 것으로 기대합니다.

tracking-drosophila-larval-behavior-response-to-optogenetic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

여기서 우리는 후각 자기 - 밧줄 (OMT) 장치에 대한 취득 비디오 이미지를 최적화하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 visuo - 후각 융합을 공부 두 가지 샘플 실험 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila의 비행 중 시각 인한 악취 추적

이 비디오는 후각 감각 뉴런(ORN)의 광유전학적 자극에 대한 초파리 유충의 탐색 행동에 대한 연구를 보여줍니다. ORN에서 빛에 민감한 이온 채널을 발현하는 형질전환 초파리 유충은 행동 영역 내의 아가로스에 배치됩니다. 빛을 이용한 광유전학적 자극은 채널을 열어 양이온 유입을 일으켜 뇌로 신호 전달을 유발하고 탐색 행동이 기록됩니다.

후각 감각 뉴런의 광유전학적 자극에 반응하는 초파리 유충의 탐색 행동

이 비디오는 리간드 결합 및 형광 이미징을 사용하여 초파리에서 감각 뉴런 반응을 감지하는 방법을 보여줍니다. 리간드는 뉴런 수용체에 결합하여 칼슘 유입을 일으킵니다. 칼슘은 지표 복합체에 결합하여 형광 방출을 유발하여 리간드에 대한 신경 반응을 확인합니다.

Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

유전자 인코딩 optogenetic 도구에서 특정 뉴런의 비 침투 조작을...

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을...

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

자동화 추적 시스템 Flywalk는 초파리에서 냄새 유도 행동 고해상도 정량화를 위해 사용된다.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

여기에서는 최대 100마리의 식초파리(Drosophila melanogaster)의 후각 반응을 분석하기 위한 행동 설정 및 데이터 분석 방법을 설명합니다. 이 시스템은 단일 또는 다중 후각 자극과 함께 사용할 수 있으며 신경 세포 하위 집합의 광유전학적 활성화 또는 침묵에 적응할 수 있습니다.

의 컴퓨터 추적하여있는 분석 후각 행동<em&gt; 초파리</em&gt; 네 사분면의 후각에

이 프로토콜은 초파리 애벌레 광전술 행동을 조사하기 위해 빛 점 분석기를 소개합니다. 이 분석에서, 광 반점은 빛 자극으로 생성되고, 애벌레 광 회피의 과정은 적외선 광 기지를 둔 화상 진찰 시스템에 의해 기록됩니다.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster를 사용하여 설탕 유도 검색 행동을 기록하기 위한 행동 분석을 설명합니다. 이 분석은 먹이 및 먹이 찾기 관련 행동뿐만 아니라 기본 신경 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초파리에서 설탕 유도 국소 검색 행동 추적

이 논문은 CsChrimson 및 GtACR2를 활용하여 특정 뉴런을 활성화하고 침묵시키는 Drosophila melanogaster의 광유전학적 조작 방법을 제시합니다. 광유전학을 활용하여 열택 및 미각 행동을 탐구하고 이러한 과정을 제어하는 기본 신경 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 네 가지 실험이 설명됩니다.

Drosophila melanogaster에서 신경 회로의 광유전학적 조작을 위한 행동 분석

학습하세요 Drosophila 애벌레의 후각 신경 optogenetic 자극에 따른 행동 반응 분석 방법입니다. 630nm 파장의 빛을 이용해 특정 후각 수용 신경을 활성화하고 애벌레의 이동 행동을 정밀하게 추적합니다.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

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