La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la spécificité de la protéase dans plusieurs extraits bruts. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés pour déterminer la spécificité de la protéase. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’identifier la spécificité de la protéase de plusieurs échantillons en parlay.

Échantillons de tissus pulmonaires froids obtenus à partir de souris ICR mâles dans de la glace. Homogénéiser les échantillons à 20 000 RMP pendant 30 secondes dans un mélangeur. Répétez cette étape jusqu’à ce que les échantillons soient complètement homogènes.

Ne pas homogénéiser plus d’une minute en continu afin d’éviter une augmentation de la température. Transférez 1 000 microlitres d’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez pendant cinq minutes à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Transférez 500 microlitres de surnageant dans un nouveau tube en plastique de 1,5 millilitre.

Utilisez 10 microlitres de l’échantillon pour déterminer la concentration en protéines. À l’aide de méthodes, telles que le dosage de l’acide bicinchoninique ou le dosage de Bradford. Pour éviter le gel, ajoutez 80 % de glycérol aux échantillons pour une concentration finale de 50 % de glycérol.

Pour clarifier la différence de spécificité de la protéase en fonction du pH, utilisez des tampons de digestion ajustés aux pH trois, cinq, sept et neuf. Dans 890 microlitres d’un tampon de digestion, ajoutez soit 10 microlitres de 0,1 microgramme par microlitre ou de trypsine TPCK, soit 0,1 microgramme par microlitre de protéase V8 de staphylocoque doré, soit 10 microgrammes par microlitre d’extraits de tissus. Préparez des contrôles négatifs en inactivant la protéase dans les extraits de tissus par incubation et en faisant bouillir de l’eau pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de substrats de biotine MNO aux échantillons et incubez pendant trois heures à 37 degrés Celsius pour digérer. Après l’incubation, arrêtez la digestion des substrats avec de l’eau bouillante pendant 10 minutes. Centrifugez les substrats digérés pendant cinq minutes à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 50 millilitres de billes de sépharose à 50 % de streptavidine dans un tampon molaire tris, contenant 0,1 % de polyoxyéthylène octylphényléther . Utilisez du papier réactif pour vous assurer que la solution est autour du pH neuf.

Il est important d’ajuster le bon pH à neuf ou plus. L’aminobiotine ne peut pas mordre une perle à moins qu’elle n’ait un pH de neuf ou plus. Si le pH de la solution est bas, ajustez-le à environ pH neuf en ajoutant plus de tampon.

De plus, un tampon molaire peut être ajouté pour augmenter le pH si nécessaire. Incuber la suspension pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec un mélange doux continu sur une roue rotative pour lier les substrats marqués à la biotine MNO à la streptavidine. Les billes doivent rester en suspension tout au long de l’incubation.

Le lendemain, centrifugez les échantillons pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, lavez les billes en ajoutant 1 000 microlitres d’un tampon de lavage. Ensuite, incubez pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec un mélange doux et continu sur un rotateur.

Centrifugez les billes pendant une minute à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et répétez ce lavage quatre fois. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,2 % aux billes.

Utilisez du papier réactif pour vous assurer que la solution est inférieure au pH deux. Si le pH de la solution est élevé, ajustez le pH en dessous de deux en ajoutant 1 % d’acide trifluoroacétique. Incuber la suspension pendant 30 minutes à température ambiante avec un mélange doux et continu sur une roue rotative.

Après avoir centrifugé les billes comme précédemment, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Pipetez 20 microlitres d’acétonitrile sur une résine C18 pour l’activer. Retirez l’acétonitrile usagé et répétez cette étape d’activation trois fois.

Ensuite, équilibrez la résine C18 avec 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Retirez l’éluant et répétez cette étape d’équilibrage trois fois. Pour charger les échantillons, fixez-les à la résine à l’aide d’une pipette.

Lavez la résine avec 20 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 %. Répétez cette étape cinq fois. Éluer les échantillons avec trois microlitres d’acétonitrile à 60 % dans de l’acide trifluoroacétique à 0,1 %.

Pipeter l’éluant sur une plaque cible pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Ajouter immédiatement la solution CHCA, saturée en 50 % d’acétonitrile et en 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Cristalliser le mélange par séchage à l’air.

Acquérir les spectres de masse des échantillons, selon le protocole du fabricant de l’instrument, en accordant une attention particulière aux spectres de masse de 700 à 900 daltons pour la forme clivée des substrats des marqueurs de biotine. Les spectres de masse des substrats synthétiques sont présentés ici. Des pics correspondant à la masse moléculaire du précurseur ont été détectés entre 850 et 1 050.

Les fragments clivés sont détectés dans la gamme de 700 à 850. Voici les spectres des substrats marqués à la biotine MNO traités avec de la trypsine TPCK. Les pics de 839,81 daltons et 796,76 daltons correspondent aux fragments clivés de l’extrémité C de la lysine et de l’arginine respectivement.

Voici les spectres de masse des substrats synthétiques digérés avec la protéase V8. Les pics de 769,78 daltons et 755,62 daltons correspondent aux fragments clivés de l’extrémité C de l’acide glutamique et de l’acide aspartique respectivement. Les spectres des substrats de marquage à la biotine MNO traités avec un extrait de tissu pulmonaire à diverses conditions de pH sont présentés ici.

À l’état acide, à un pH cinq, le poids moléculaire d’un fragment clivé était de 770,13 daltons et 826,66 daltons, indiquant un clivage à l’extrémité C de l’acide glutamique et du tryptophane. À l’état neutre et basique, à pH sept et neuf, le poids moléculaire d’un fragment clivé a augmenté au pic de 767 daltons et 840 daltons, indiquant clivé à l’extrémité C de l’arginine et de la lysine. À l’inverse, les pics d’acide glutamique et de tryptophane ont diminué.

De plus, cette méthode ne permet pas de détecter les fragments clivés avec des extraits inactivés. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en deux jours si elle est bien réalisée, sauf pour la synthèse de substrat. De plus, une fois le substrat synthétisé, il peut être mesuré dans plusieurs échantillons. Pourquoi?

En essayant cette procédure, il est important de se rappeler de fonctionner au pH tampon, environ neuf. Généralement, la réaction du complexe avidine amino-biotine. Suite à cette procédure, il est possible de quantifier l’activité enzymatique en effectuant une CMS.

Cette méthode permettra aux chercheurs dans le domaine des protéons d’ouvrir la voie à l’exploration de l’expression de la protéase dans plusieurs conditions.