Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

이 Microinjection 프로토콜의 전반적인 목표는 Western Corn Rootworm 게놈을 변형하는 것입니다. 이 방법은 Western Corn Rootworm 생물학과 BT 독소 및 RANI와 같은 해충 방제 방법을 신속하게 극복하는 능력에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 서부 옥수수 뿌리벌레 외에도 이 방법은 남부 및 북부 뿌리벌레와 같은 유사한 종에도 적용할 수 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 90년대에 Western Corn Rootworm에서 주입 기반 RANI를 도와달라는 요청을 받았을 때 처음 떠올랐습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 실험실에서 서부 옥수수 뿌리 벌레를 사육하는 것은 노동 집약적이기 때문입니다.

그리고 생존율은 현재 기술을 사용하여 낮은 상태로 유지됩니다. 신뢰할 수 있는 회사나 연구소에서 500-1,000마리의 비일석(non-diapausing rootworm) 성충을 구하십시오. 그리고 30입방센티미터의 케이지에 수용합니다.

표준 뿌리벌레 인공 사료는 약 1cm 깊이의 식품 저장 용기에 보관하십시오. 사용하지 않은 식단은 섭씨 4도에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다. 뿌리벌레에게 먹이를 주려면 100cm의 페트리 접시에 10-15g의 사료를 넣으십시오.

각 뿌리벌레 우리에 한 접시의 음식을 넣으십시오. 그리고 공급이 부족하거나 식단이 건조할 때 보충하십시오. 또한 각 케이지에 면봉으로 덮인 300ml의 물통을 수원으로 사용할 수 있도록 하십시오.

물이 부족할 때 교체하십시오. 우리에 갇힌 뿌리벌레를 섭씨 26도, 습도 60%, 14/10 조명 주기로 곤충 사육 인큐베이터에서 유지하십시오. 자정과 같이 늦은 시간에 불을 끄도록 설정하여 아침 근무 시간 전에 알을 낳습니다.

먼저 배아를 채취합니다. 난자 채취 표면의 경우 100mm 페트리 접시에 30ml의 1%한천과 물을 넣습니다. 다음으로, 한천에 여과지를 한 겹 바르고 치즈 천 4 층을 놓습니다.

각 레이어는 크기에 맞게 잘라야 합니다. 다음으로, 가능한 한 늦은 시간에 알 채취 플레이트를 뿌리벌레 케이지에 넣고 은박지 텐트로 덮습니다. 그런 다음 다음 아침에 난자 채취실을 제거하십시오.

집게를 사용하여 한 번에 한 겹의 치즈 천을 집어 물이 담긴 500ml 비커에 넣습니다. 치즈 천에 묻은 달걀을 물에 휘저어 씻어냅니다. 그런 다음 전구 피펫을 사용하여 세척 단계로 계란을 다른 물 비커로 옮깁니다.

이런 식으로 두세 번 세탁하십시오. 그런 다음 청소한 계란을 가능한 한 적은 물로 여과지에 놓습니다. 다음으로, 대비를 개선하기 위해 검은색 여과지 조각을 슬라이드에 평평하게 테이프로 붙여 슬라이드를 준비합니다.

그런 다음 계란을 고정하는 데 사용할 종이에 무독성 접착제의 미세한 선을 이슬비로 뿌립니다. 접착제를 달걀 둘레 아래에 두십시오. 접착제가 젖은 상태에서 가는 브러시를 사용하여 계란을 접착제 라인에 놓습니다.

각 알 사이에 적어도 하나의 알 거리를 유지하십시오. 슬라이드당 여러 줄의 계란을 준비합니다. 이제 난자는 30분 이내에 주입되어야 합니다.

이제 helper plasmid, donor plasmid 및 phenol red buffer를 결합합니다. 내독소가 없는 상업용 키트로 만든 고품질의 슈퍼 코일 플라스미드를 사용하십시오. Fortex를 간단히 혼합합니다.

그런 다음 최대 속도로 3분 동안 미립자를 회전시킵니다. 다음으로, 0.5-1 마이크로 리터의 주입 용액으로 붕규산 유리 바늘을 되 메우십시오. 거품이 생기면 반드시 제거하십시오.

그런 다음 주사 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 부착합니다. 이제 필요한 경우 현미경으로 미세한 집게를 사용하거나 끝을 유리 장벽에 부드럽게 만져 밀봉된 바늘 끝을 부드럽게 부수십시오. 주입 용액을 방출하는 가능한 가장 작은 구멍을 만드십시오.

뿌리벌레 알을 주입하기 전에 고운 붓을 사용하여 준비된 알 1-3개의 표면을 멸균수로 조심스럽게 적십니다. 그런 다음 젖은 배아를 주입합니다. 배아 중앙에 바늘을 부드럽게 삽입하고 소량의 용액을 주입합니다.

10-13psi의 압력을 사용하여 시작하고 필요에 따라 압력을 조정하십시오. 건조 배아는 뚜렷한 둥근 모양을 가지고 있으며, 각 배아를 물로 미리 적시면 모양이 바뀌고 난각이 부드러워져 바늘이 쉽게 침투할 수 있습니다. 성공적으로 주입된 배아는 소량의 붉은색을 띱니다.

난자가 손상되었거나, 이상하게 보이거나, 주입할 수 없는 경우 부수거나 슬라이드에서 제거하십시오. 모든 계란을 주입한 후 계란이 있는 여과지를 1% 한천 접시에 옮깁니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 유충이 부화할 때까지 섭씨 26도에서 배양합니다.

주사 후 12일이 지나면 다음 2주 동안 매일 유충이 있는지 확인하기 시작합니다. 고운 솔을 사용하여 유충을 발아 옥수수와 흙이 있는 사육 상자로 옮겨 표준 조건에서 사육합니다. 뿌리웜의 생식세포 형질전환은 전세포 배아에 플라스미드를 운반하는 트랜스포손과 함께 플라스미드를 운반하는 트랜스포사제를 동시 주입하여 시도되었습니다.

26명의 생존자에서 각 EFP 발현은 공여체 요소 삽입을 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 흉부 자손이 확인되었지만, 강렬한 광원으로 뿌리벌레 배아를 검사하는 것은 치명적임이 입증되었습니다. 생식세포 형질전환의 다음 라운드는 Drosophila melanogaster의 구조적으로 활성화된 프로모터에 의해 구동되는 적색 형광 단백질 유전자를 사용했습니다.

생존율은 향상되었지만, DS 적색 양성 유충은 단 한 마리만 기록되었습니다. 다음으로, 배아를 완충액 단독 또는 helper 및 thorescently marked donor DNA plasmids와 함께 마이크로 주입했습니다. 플라스미드 또는 완충액만 주입할 때 부화한 배아의 비슷한 비율.

그리고 흥미롭게도, 주입되지 않은 배아 중 약 절반만이 부화했다. 이것은 주사를 위해 배아를 조작하는 치사율을 주사를 수행하는 것만큼이나 높게 만들었다. 이 비디오를 시청한 후에는 Western Corn Rootwall 배아를 미세 주입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 숙달되면 이 기술을 사용하여 시간당 2-300개의 배아를 주입할 수 있습니다. 이 방법은 다른 많은 종에 적용할 수 있는 템플릿 역할을 하는 Drosophila melanogaster의 생식세포 형질전환을 위해 개발된 기술에 빚지고 있습니다. 이 절차에 따라 CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집과 같은 다른 방법을 수행하여 Western Corn Rootwall의 게놈에서 표적 돌연변이를 만들 수 있습니다.

게놈 기능에 대한 구체적인 질문에 답하기 위해.