Name: Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin, yetişkin Schistosoma japonicum'dan ekstraselüler vezikülleri izole etme yöntemini. Bu protokol, parazitler üzerindeki stresi en aza indirerek fizyolojik EV salınımını sağlar ve parazitoloji araştırmalarına katkıda bulunur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, kısmen ya da bütün olarak, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31472187 ve 31672550) ve tarım bilim ve teknoloji yenilik programı Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından desteklenen.

Tüm hayvan deneyleri Yerel Etik Komite Shanghai veteriner Araştırma Enstitüsü, Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından kabul edildi (izin numarası: SHVRIAU-14-0101).
1. Schistosomes in Vitro kültür
Not: Schistosomes bir biohazard temsil eder. İşçi hepsini ne zaman işleme solucanlar, schistosomal süspansiyonlar veya diğer biyolojik malzemeler ilgili kez lateks eldiven giymek gerekir. Yeni Zelanda tavşanları ~ 2.000 cercariae yolu ile karın pozlama ile bulaşmış. Schistosomes karaciğer aşamada tavşan S. japonicum cercariae 28 gün sonrası enfeksiyon, karaciğer ve mezenterik damarların perfüzyon tarafından enfekte üzerinden toplanmıştır. Solucan koleksiyonu yordamlar önceki yayınlarda fareler18çalışmalarda raporlama başvuru.
<ol><li>Parazitleri bir 500 mL ölçek toplamak. Onları iyice yıkayın ve yavaşça 3 x 200 mL ile (37 ° C) PBS (pH 7,4) ısıtılmış.</li>
	<li>Her 90 mm Petri kabına için ~ 200 solucan çiftleri ayırmak. Parazitler iyice yıkayın ve hafifçe 2 x 50 mL ile (37 ° C) RPMI-1640 Kültür 100 U penisilin ve 100 mg/mL streptomisin içeren orta ısıtılmış.</li>
	<li>Parazitler olmadan antibiyotik altında %5 CO2 ~ 5 solucan çiftleri /mL 2 90 mm Petri s için yoğunluğu, çanak 37 ° C'de ısıtılmış RPMI-1640 kültür ortamının 40 ml korumak. Notlar: RPMI 1640 orta serum içermemesi gerekir, aksi takdirde eksojen ekstraselüler vezikül tanıtılacaktır.</li>
</ol>2. tedavi ön koşulu medya
<ol><li>Kültür orta toplamak ve 2.000 × g yumurta kaldırıp tegmental enkaz solucan 30 dk için 4 ° C'de orta santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant aktarmak için taze bir tüp ve 0,22 µm şırınga filtre kullanarak çözüm filtre uygulayabilirsiniz.</li>
	<li>Filtre uygulanmış çözüm diyaliz çantaya toplamak (moleküler ağırlık kesme: 3.5kD) ve gecede 4 ° C'de % 8 ' PEG8000 çözüm kullanarak çözüm diyaliz. Notlar: SjEVs yalıtım verimi artırmak için SjEVs zenginleştirmek önemli bir adımdır.</li>
</ol>3. SjEVs yalıtım
<ol><li>Diyaliz çözüm için yeni bir tüp aktarmak ve toplam eksozom yalıtım reaktif 0.5 birimleri ekleyin.</li>
	<li>Çözüm de tarafından vortexing veya yukarı ve aşağı polimerlerin çözüm sağlamak için pipetting karıştırın.</li>
	<li>2 ° C-8 ° C karisimin gecede kuluçkaya.</li>
	<li>2 ° c ile 8 ° c 1 h için 15.000 × g karisimin santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Aspire edin ve süpernatant atın. Notlar: EVs (görünmeyen Olguların çoğunda) tüp alt Pelet bulunur.</li>
	<li>EVs Pelet 2 mL PBS resuspend ve daha fazla çözümleme kadar EVs çözüm-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>4. Western blot tarafından EVs karakterizasyonu
<ol><li>Örneğin, BCA tahlil tarafından SjEVs örnek protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
	<li>10-20 µg EVs 22.5 µL RIPA arabelleği, hazır olun. Sonra arabellek ve ısı 95 ° C'de 5 min için yükleme x 4 7,5 µL ekleyin</li>
	<li>Ayrı SjEVs proteinler tarafından % 12 SDS-sayfa jel.</li>
	<li>PVDF membran proteinleri aktarmak ve anti-tavşan IgG-HRP ile (1:5, 000 seyreltme) sondalama tarafından takip anti-CD63 antikorlar (1:1, 000 seyreltme), ile sonda.</li>
	<li>ECL algılama reaktif membran geliştirme için kullanın ve görüntüleme sistemi Kemiluminesan tarafından sinyalleri tespit.</li>
</ol>5. EVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu
<ol><li>İzole SjEVs 2 µL 200 mesh formvar kaplamalı ızgaralar için ekleyin ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Phosphotungstic asit, 1 dk. için %2 ile leke ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Izgaralar transmisyon elektron mikroskobu örnek sahibinin üzerine yük ve bir 80 kV elektron ışını görüntü yakalama için maruz.</li>
</ol>6. SjEVs PKH67 ve hücre alımı tahlil etiketle
Notlar: Tüm sonraki adımları ortam sıcaklığında (20-25 ° C), aksi belirtilmedikçe yapıldı.
<ol><li>5 µg SjEVs çözüm Konik alt polipropilen boru aktarmak ve 12 ml RPMI 1640 orta ekleyerek ses seviyesini.</li>
	<li>SjEVs cips için SjEVs 110.000 × g 4 ° C'de 90 dk için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Santrifüjü sonra dikkatle süpernatant Aspire edin. Not: Bu türdeş olmayan boyama ve azaltılmış hücre canlılığı neden gibi PKH67 ethanolic boya SjEV Pelet doğrudan, eklenmelidir değil.</li>
	<li>2 x EV süspansiyon çözüm SjEV Pelet Dilüent c 1 mL ekleyerek hazırlamak; tam dağılım sağlamak için nazik pipetting ile resuspend.</li>
	<li>Dilüent C boyama önce taze bir 2 x boya çözüm PKH67 ethanolic boya çözüm 2 µL Dilüent C 1 mL polipropilen santrifüj tüpü içinde ekleme ve de dağıtmak için karıştırma hazırlayın.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde EV süspansiyon (adım 6.4) 2 x boya çözüm (adım 6.5) ve hemen 1 ml örnek pipetting tarafından mix 2 x 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Karışımı, oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>4 mL FBS ekleyerek boyama durdurmak ve 1 dk. için kuluçkaya.</li>
	<li>RPMI1640 orta 12 ml ses seviyesini ve 110.000 × g 90 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi için ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırın ve RPMI1640 orta SjEV granül etiketli PKH67 resuspend ekleyin.</li>
	<li>Bir kez yıkama ve PBS SjEVs granül resuspend eklemek için 90 dakika için 4 ° C'de 110.000 × g, santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>7. SjEVs hücre alımı tahlil
<ol><li>Tohum memeli hücreleri NCTC gibi clone 1469 hücreleri ya da 6-şey plaka (2 × 105 hücreleri de başına) hücrelerde HEK293T ve hücreleri gecede kültür.</li>
	<li>5 µg PKH67 etiketli SjEVs ekleyin ve 2-4 h için 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
	<li>Kuluçka sonra orta kaldırmak ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>%4 formaldehit solüsyonu 15dk için hücreleri tamir ve iki kez PBS ile daha fazla yıkadım.</li>
	<li>Hücre çekirdeği ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile leke.</li>
	<li>Floresans mikroskobu kullanarak hücreleri gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

EVs üzerinde son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs ana bilgisayar-patojen etkileşimleri3,9,12,16' önemli bir rol oynamaktadır bu paraziti gösterdi. Daha fazla adrese düzenleyici işlevleri, EVs schistosomes yalıtmak için gerekli olduğunu. Burada, SjEV yalıtım için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem SjEVs, geniş Aralık boyutunu 100 verimleri nm 400 nm, Yetişkin S. japonicum...

Hücre dışı veziküller (EVs) küçük membran bağlı veziküller çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitler ile kapsüllü bir nüfusu vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs hücre-hücre iletişim çok önemli bir rol oynamaktadır ve hücre gelişimini, bağışıklık düzenlemesi, anjiogenez ve hücre geçiş2de dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik süreçlerin yönetmelikte yer gösterdi, 3,4,5. Delil biriktiriyor EVs, exosomes ve onların miRNA kargo dolaşan bazı hastalıklar6potansiyel biyolojik temsil ettiğini gösterir.
Trikomonas vajinalis, Trypanosoma cruzive LEISHMANIA sppgibi birkaç protozoa., EVs; salgılar edebilmek için gösterilen archlar Ayrıca bulundu EVs yaşam içine salgılaması için7ev sahipliği yaptı. Paraziter EVs enfeksiyon, patojen8ve bağışıklık Yönetmeliği9bakım dahil olduğu gösterilmiştir. Son schistosomes içinde her iki Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 çalışmalar ve S. japonicum12 yetişkin schistosomes olabilir eksozom benzeri veziküller salgılar belirtilmiştir var Belirli biyolojik süreçlerin fonksiyonel Yönetmeliğinde yer.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler ultrasantrifüj, Ultrafiltrasyon13, polimer esaslı reaktifler, boyut-dışlama Kromatografi ve immunoaffinity yalıtım kullanımı gibi hücre dışı veziküller izole etmek için kullanılmıştır. Bu farklı yöntemler kendi avantajları ve sınırlamalar14bulunur. Genel olarak, ultrasantrifüj vezikül yalıtım için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Ancak, bu yöntem potansiyel EV toplama14sınırlama uğrar.
Schistosomes, yöntemleri bir çift EV yalıtımı için bildirilmiştir: Bu ultrasantrifüj11,12,10 ve çeşitli aşamalarında (yumurta16, ticari EV yalıtım Seti16 kullanımını içerir schistosomula11, Yetişkin schistosomes10,12,17). Microvesicles birkaç yüz nanometre boyutundan bin nanometre için geniş bir göz önüne alındığında olduğuna göre biz tezgah santrifüj, Ultrafiltrasyon ve üzerinden EVs yalıtmak için ticari bir EV izolasyon kit kullanımı ile birleştiren alternatif bir yöntem geliştirdi Yetişkin Schistosoma japonicum. İzole EVs genellikle 100-400 nm çapında sahip ve başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Toplam Eksozom İzolasyon Reaktifi (hücre kültürü ortamından)</td> <td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>S. japonicum hücre dışı vezikülleri izole etmek için</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>etiketlemek için ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>Parazit kültürü için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher BİLİMSEL</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&mu; m şırınga filtresi</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Diyaliz Tüpü</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Değirmen & ticaret; İmmobilon ve ticaret; Batı Kemilüminesan HRP Substrat (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kiti</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 antikorları</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar / Karbon 400 ağ</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Fosfotungstik Asit</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC klonu 1469 hücre</td><td>ATCC ATCC</td><td>& reg; CCL-9.1 ve ticaret;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipmanlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE kemolüminesans görüntüleme sistemi</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q su</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultrasantrifüj</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

yalıtım ve yetişkin schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Hücre dışı veziküller (EVs) membranöz veziküller hücreler çeşitli hücre dışı microenvironment içine tarafından yayımlanan vardır. EVs heterojen veziküller, nüfusu 40 ve 1000 nm arasında bağlantı boyutu aralığı temsil eder. Birikmiş kanıt EVs patojen-host etkileşimlerde önemli düzenleyici rol oynarlar belirtti. Paraziti EVs derin bir anlayış anlayışlar paraziti-ana etkileşimler, şistozomiyazis karşı yeni strateji geliştirme sağlayan temel mekanizmaları sağlamalıdır. Burada, daha fazla yetişkin Schistosoma japonicum (S. japonicum) yalıtım ve EVs karakterizasyonu için bir protokol sunarak schistosomes işlevlerinde EVs çalışma hedefliyoruz. EVs vitro kültür bir ticari eksozom izolasyon kiti ile kombine Santrifüjü kullanarak ortamdan izole edildi. İzole S. japonicum EVs (SjEVs) genellikle 100-400 nm çapında sahip ve iletim elektronik mikroskobu ve western Blot ile karakterizedir. SjEVs boya etiketli PKH67 kullanımını SjEVs alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Genel olarak, bizim iletişim kuralı EVs yetişkin schistosomes izole için alternatif bir yöntem sağlar; izole SjEVs fonksiyonel analiz için uygun olabilir.

İzole SjEVs açıklanan protokolünü kullanarak verimini ölçmek için biz BCA protein tahlil izole SjEVs protein konsantrasyonu 28 günlük yetişkin schistosomes erişmek için kullanılır. Tablo 1' de gösterildiği gibi SjEV protein konsantrasyonu 208 µg Orta (Tablo 1) 100 mL başına 250 µg arasında değişiyordu. İzole SjEVs 100 değişiyordu Malvern nanopartikül analiz, belirlenen partikül büyüklüğü belirtilen 400 nm nm ile en yüksek nüfus yaklaşık 220 nm boyutunda (...

Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro kültürlenmiş yetişkin Schistosoma japonicum ortamından hücre dışı vezikülleri izole etmektir. Bu yöntem, EV'yi in vitro kültür ortamında yetişkin Schistosoma japonicum'dan verimli bir şekilde izole edebilir. Bu tekniğin ana avantajı, hücre dışı vezikülü kısa süreli in vitro kültür ortamından verimli bir şekilde izole edebilmesidir, bu da potansiyel olarak fizyolojik olmayan EV sekresyonuna neden olan stresi en aza indirebilir.Gösteri, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Juntao Liu tarafından yapılacak. Parazitleri 500 mililitrelik bir beherde toplayın ve 200 mililitre ılık PBS kullanarak üç kez iyice ama nazikçe yıkayın. Yıkamaları kısa tutun ve parazitleri ayırmak için yerçekimi sedimantasyonunu kullanın.Daha sonra, 90 milimetrelik tabaklara, tabak başına yaklaşık 200 solucan çifti tabağı. Çanakta, yerçekimi sedimantasyonu kullanarak parazitleri iki kez daha yıkayın. Bu yıkamalar için, pen-strep ile desteklenmiş ılık RPMI ortamı kullanın.İkinci yıkamayı antibiyotiksiz 40 mililitre ortamla değiştirin. Daha sonra parazitleri iki saat boyunca% 5 karbondioksit altında% 37 santigrat derecede kültürleyin. İki saat sonra, ortamı plakalardan santrifüj tüplerine aktarın ve ardından yumurtaları ve solucan kalıntılarını dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.000 g'da toplayın.Ardından, süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, süpernatanı 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve filtrelenmiş çözeltiyi, 3.5 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimi olan bir diyaliz torbasına toplayın. Daha sonra, çözeltiyi% 8 PEG8000 çözelti kullanarak gece boyunca dört santigrat derecede diyalize edin.Bu adım, hücre dışı veziküllerin verimini artırmak için önemlidir. Ertesi gün, diyalize edilmiş çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın ve toplam eksozom izolasyon reaktifinden 0.5 hacim ekleyin. Çözeltiyi homojen olana kadar karıştırın ve gece boyunca yaklaşık beş santigrat derecede inkübe edin.Ertesi sabah, karışımı yaklaşık beş santigrat derecede bir saat boyunca 15.000 g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve atın ve EV'lerin peletini iki mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Pelet muhtemelen görünmeyecektir.Western blot analizi için, önce BCA tahlilinde olduğu gibi numunenin protein konsantrasyonunu belirleyin. Ardından, 22,5 mikrolitre RIPA tamponunda 10 ila 20 mikrogram EV hazırlayın. Daha sonra, 7,5 mikrolitre 4X yükleme tamponu ekleyin ve karışımı beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.Isıl işlemden sonra, hücre dışı vezikül proteinlerini %12'lik bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayırın. Jeli çalıştırdıktan sonra, proteinler PVDF zarına aktarılır. Membranı anti-CD63 antikorları ile bir ila 1.000 seyreltmede araştırın.Daha sonra, zarı bir ila 5.000 seyreltmede tavşan önleyici IgG-HRP ile muamele edin. Şimdi, zarı geliştirmek için bir ECL algılama reaktifi kullanın ve ardından bir kemilüminesans görüntüleme sisteminde analiz yapın. Beş mikrogram numuneyi bir polipropilen ultrasantrifüj tüpüne aktarmakla başlayın ve hacmi RPMI-1640 ortamı ile 12 mililitreye ayarlayın.Ardından, numuneyi dört santigrat derecede 90 dakika boyunca 110.000 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Ardından, pelete bir mililitre seyreltici C ekleyerek 2X hücre dışı vezikül süspansiyonu hazırlayın.Peleti nazik pipetleme ile yeniden süspanse edin. Şimdi taze 2X boya çözeltisi hazırlayın. Bir mikrofüj tüpünde bir mililitre seyreltici C'ye iki mikrolitre PKH67 etanolik boya ekleyin ve iyice karıştırın.Ardından, iki çözeltiyi karıştırarak ve karışımı oda sıcaklığında dört dakika inkübe ederek numuneyi boyayın. Ardından, dört mililitre FBS ekleyerek ve bir dakika daha bekleyerek lekelenmeyi durdurun. Ardından, hacmi 12 mililitreye ayarlamak için RPMI-1640 ortamı ekleyin ve lekeli vezikülleri izole etmek için süspansiyonu aşağı döndürün.Süpernatanı çıkarın ve atın. Ardından, peletlenmiş PKH67 etiketli EV'leri 12 mililitre RPMI-1640 ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra santrifüjlemeyi tekrarlayın, ancak bu sefer vezikülleri bir mililitre PBS'de toplayın.Alım tahlili için, altı oyuklu plakalarda memeli hücrelerinin gece boyunca kültürlerini hazırlayın. Ertesi sabah, her bir oyuğa beş mikrogram PKH67 etiketli vezikül ekleyin ve kültüre iki ila dört saat devam edin. İnkübasyondan sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra, hücreleri 15 dakika boyunca sabitleyin, PBS ile iki kez yıkayın ve görüntülemeden önce DAPI ile boyayın. Karaciğer evresindeki şistozomlar, enfeksiyondan 28 gün sonra tavşanlardan toplandı. Hücre dışı veziküller daha sonra şistozom solucanlarından toplandı ve analiz edildi.Malvern nanopartikül analizi ile belirlenen partikül boyutları, 100 ila 400 nanometre arasında değişiyordu ve nüfusun büyük kısmı 220 nanometreye yakındı. Transmisyon elektron mikroskobu, hücre dışı veziküllerin yuvarlak ve çapının 100 ila 200 nanometre arasında olduğunu ortaya çıkardı. Western blotlama analizi, izole edilen hücre dışı veziküllerin, tipik bir hücre dışı vezikül belirteci olan CD63 antikorları kullanılarak tanındığını gösterdi.NCTC klonu 1469 hücreleri tarafından içselleştirilen PKH67 işaretli hücre dışı veziküllerin floresan mikroskobu, hücre dışı veziküllerin esas olarak alıcı hücrelerin sitoplazmasında dağıldığını gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, EV'nin in vitro kültür ortamında yetişkin Schistosoma japonicum'dan nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, küçük hücre dışı veziküller (EVs) tüm dokular, beyin ve tümör örnekleri de dahil olmak üzere gelen yalıtmak için detaylı bir protokol sağlar. Bu yöntem daha da aşağı akım analizleri için sağlam doku EVs ayıklamak için tekrarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre dışı veziküller çekme--dan tüm doku

Bu makalede, caenorhabditis elegans hücre dışı veziküller üretmek, arındırmak ve ölçmek için yöntemler sunar.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Mevcut protokol, mikroRNA'ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA'larla sonuçlanır.

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Burada, kollajenaz tip I ile sindirim ve ultrasantrifüjlemenin bir kombinasyonunu kullanarak fare dalağından türetilmiş eksozomları izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, mekanik dekolman, enzimatik ayrışma, filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla iskelet kası interstisyel hücre dışı veziküllerini (SkM-EV'ler) kemirgen kas dokularından izole etmeyi ve saflaştırmayı amaçlar. Tutarlılık ve güvenilirlik gösterir. İzole edilmiş SkM-EV'ler, tanısal biyobelirteçler veya terapötik araçlar olarak potansiyel uygulamalarla birlikte kas homeostazı ve hastalıkları hakkında bilgi sağlar.

İskelet Kası İnterstisyel Hücre Dışı Veziküllerin Enzimatik İzolasyonu

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma mansoni yumurta T hücre tip 2 (Th2) immün yanıt, parazit enfeksiyonu karakteristik, astım ve allerjik inflamasyonun güçlü uyarıcılar vardır. Bu protokol S. kullanır CD4 Th2 sitokin bağlı inflamatuar yumurtanın etrafında akciğer granülom oluşumu ile karakterize, akciğerin yanıt, eozinofili ve makrofaj aktivasyonu alternatif oluşturmak için mansoni yumurta enjeksiyon.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Öğrenin, yetişkin Schistosoma japonicum'dan ekstraselüler vezikülleri izole etme yöntemini. Bu protokol, parazitler üzerindeki stresi en aza indirerek fizyolojik EV salınımını sağlar ve parazitoloji araştırmalarına katkıda bulunur.

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet