Name: Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Erfahren Sie die elektrochemische Detektion des Deuterium-Kinetik-Isotopeneffekts bei Shewanella oneidensis MR-1. Diese Methode untersucht den Protonentransport im extrazellulären Elektronentransport lebender Bakterien.

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Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für speziell gefördert Forschung von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-Nummer 24000010, 17 H 04969, und JP17J02602, die uns Office of Naval Research Global (N62909-17-1-2038) finanziell unterstützt. Y.T JSPS Research Fellow und unterstützt von JSPS durch das Programm für führende Graduierten Schulen (Verdienst).

1. Bildung von Biofilm Monolayer von S. Oneidensis MR-1 auf einer ITO-Elektrode (Abbildung 1)
Hinweis: Um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors mit anderen Mikroben zu verhindern, sollten alle Medien, Geräte und Komponenten des elektrochemischen Reaktors im Voraus sterilisiert werden. Wenn MR. S. Oneidensis -1 Zellen und konstruieren die elektrochemischen Reaktoren, alle Verfahren auf einer sauberen Werkbank durchgeführt werden sollten.
<ol><li>Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen Hinweis: Ein Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 entstand auf einer ITO Elektrode nach den Bedingungen berichtete zuvor4.<ol>
<li>Um S. Oneidensis MR-1 Zellen wachsen, fügen Sie eine Kolonie von S. Oneidensis MR-1 auf einer nährbodenplatte bestehend aus Luria-Bertani (LB) (20 g/L) und Bacto Agar (15 g/L) in 15 mL LB-Medium (20 g/L) bei 30 ° C für 24 h unter aeroben Bedingungen mit 160 u/min schütteln angebaut.</li>
		<li>Die Zellsuspension bei 6.000 × g für 10 min zentrifugieren und Aufschwemmen der daraus resultierenden Zelle Pellet in 15 mL definierte Medium (pH 7,8) (DM: Nahco33 [2,5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1,0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] und 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] Ethanesulfonic Säure [HEPES; 7,2 g/L]), ergänzt mit 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefeextrakt als Quelle von Kohlenstoff, und Spurenelemente für S. Oneidensis MR-1 , beziehungsweise.</li>
		<li>Weiter kultivieren die Zellsuspension aerob bei 30 ° C für 12 h unter Schütteln bei 160 u/min und Zentrifugieren wieder bei 6.000 × g für 10 min. waschen das resultierende Zelle Pellet zweimal mit DM Medium durch Zentrifugation für 10 min bei 6000 × g vor der elektrochemischen Experimentieren Sie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bau eines elektrochemischen drei-Elektroden-Reaktors (Abbildung 1)<ol>
<li>Setzen Sie ein Substrat ITO als Arbeitselektrode an der Unterseite des Reaktors.</li>
		<li>Anschließend fügen Sie einen Glaszylinder (Durchmesser 2 cm) und ein Cover von Polytetrafluorethylen (PTFE). Dann fügen Sie Ag/AgCl (KCl gesättigt) und einem Platindraht in den Reaktor als die Referenz und Zähler Elektroden bzw.. Hinweis: Um das Austreten von Luft und Lösung zu verhindern, legen Sie ein Butyl-Kautschuk-Blatt zwischen einzelnen Komponenten.</li>
		<li>Fügen Sie 4,0 mL DM ergänzt mit 10 mM Laktat und Hefeextrakt 0,5 g/L in den elektrochemischen Reaktor hinzu.</li>
		<li>Fließen Sie nachdem Sie bestätigt haben, dass gibt es keine Leckage aus dem elektrochemischen Reaktor die Stickstoffgas in den elektrochemischen Reaktor über 20 min, anaerobe Bedingungen innerhalb des elektrochemischen Reaktors aufrechtzuerhalten. Hinweis: Um Verunreinigungen mit anderen Mikroben zu verhindern, sollte das Gas gefiltert werden, bevor es in den elektrochemischen Reaktor fließt.</li>
		<li>Verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit einem potentiostaten und + 0,4 V gelten (im Vergleich zu standard-Wasserstoff-Elektrode, sie) auf die ITO-Elektrode, wobei die Temperatur des elektrochemischen Reaktors bei 30 ° C mit einer externen Wasserkreislauf. Hinweis: Um die Wirkung eines externen elektrischen Feldes zu verhindern, sollte der elektrochemische Reaktor in einen Faradayschen Käfig platziert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elektrochemische Kultivierung von S. Oneidensis MR-1 Zellen (Abbildung 1 und Abbildung 2)<ol>
<li>Passen Sie die Zelle Dichte der Suspension in Schritt 1.1 zu einer optischen Dichte von 1,43 bei 600 erhaltenen nm (OD600) mit DM 10 mM Laktat und 0,5 g/L Hefe ergänzt zu extrahieren. Hinweis: Um die richtige OD600zu erhalten, gelten Sie die Zellsuspension OD600 ≤ 0,8 für eine UV-Vis-Spektrometer vor Einstellen der OD600 bis 1,43.</li>
		<li>Hinzufügen von 0,3 mL Zellsuspension in den elektrochemischen Reaktor durch die Injektion Port mit einer Spritze: die OD600 im Reaktor ändert sich auf 0,1. Hinweis: Die Zugabe von 0,3 mL Zellsuspension mit OD600 = 1,43 in elektrochemischen Reaktor mit 4,0 mL mittlere Ergebnissen in 4,3 mL der Lösung mit einer OD600 = 0,1. Bei Verwendung von anderen Reaktoren mit unterschiedlichen Volumina ist die Berechnung der Zelldichte erforderlich.</li>
		<li>Die mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie), die ITO-Elektrode für 25 h fort. Hinweis: Für die Bildung von Biofilm Monolage auf einer ITO-Elektrode, sicherzustellen Sie, dass der erzeugte Strom eine Abweichung von weniger als 50 % aus Abbildung 2zeigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM Laktat (Abbildung 3)
<ol><li>Die mögliche Anwendung zu stoppen und die potentiostaten und den Wasserkreislauf den elektrochemischen Reaktor trennen.</li>
	<li>Laktat-Ersatz des Überstands mit frischen DM Medium mit 10 mM<ol>
<li>Das Stickstoffgas fließen in eine Flasche mit DM mit 10 mM Laktat über 20 min, Sauerstoff vom Medium zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie langsam den überstand im elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze unter fließendem Stickstoffgas (Abb. 3a, b). Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode durch Stickstoffgas, sollte das Gas über der Flüssigkeitsoberfläche fließen.</li>
		<li>Zugeben Sie 4,0 mL frische DM mit 10 mM Laktat mit einer Spritze (Abb. 3 c). Hinweis: Um zu vermeiden, brechen den Biofilm auf die ITO-Elektrode, injizieren Sie langsam das Medium entlang der Mauer des elektrochemischen Reaktors. Um den Biofilm feucht zu halten, sollte das Medium sofort nach dem Entfernen des Überstandes hinzugefügt werden. Injektion von der Mittel-bis zu 1 min nach dem Entfernen des Überstandes beeinträchtigt nicht die aktuelle Produktion aus der Biofilm von S. Oneidensis MR-1.</li>
		<li>Schräge des elektrochemischen Reaktors Entfernen aller der Überstand an der Wand des elektrochemischen Reaktors befestigt.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.4 in insgesamt drei Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stoppen Sie den Gasstrom zu und verbinden Sie den elektrochemischen Reaktor mit dem potentiostaten wiederum die ITO-Elektrode bei 303 k + 0,4 V (gegen sie) zuweisen</li>
</ol>(3) Zugabe von Deuterium Wasser zur Messung der KIE auf den EET-Prozess (Abbildung 4)
<ol><li>Bestätigen Sie, dass die laufenden Produktion aus einem monomolekularen Film Biofilm von S. Oneidensis MR-1 stabil ist und wird nicht schnell erhöht. Wenn der Strom steil steigt, warten Sie, bis der Strom innerhalb einer Erhöhung um 5 % über 10 min stabilisiert. Hinweis: Eine Monolage Biofilmbildung auf eine ITO-Elektrode ohne Kontamination der andere mikrobielle Stämme rDNA Sequenzen und ein Scan Elektron mikroskopische Bild des Biofilms auf eine ITO-Elektrode, bestätigte wie zuvor4berichtet. Zur Bestätigung der Rate Beschränkung durch die EET Prozess überwachen Sie den Effekt des Hinzufügens pendelt Elektron Mediatoren wie 100 µM anthraquinon-1-Sulfonate (α-AQS). Siehe Abschnitt Vertreter Ergebnisse und15 für weitere Details verweisen.</li>
	<li>Fügen Sie 40 µL anoxischen 50 % (V/V) D2O in den elektrochemischen Reaktor mit einer Spritze, so dass die Konzentration 0,5 % (V/V) D2O im Reaktor. Hinweis: Zur Vermeidung von Schäden an den Biofilm durch D2O Zusatz injizieren Sie D2O tropfenweise.</li>
	<li>Warten Sie, bis des Stroms zu stabilisieren, und anschließend fügen Sie die D-2O bis zu 4,0 % (V/V). Hinweis: Um den KIE-Wert (das Verhältnis der laufenden Produktion in Anwesenheit D2O und H2O) zu erhalten, überprüfen Sie die Wirkung des gleichen Volumens von H2O Zusatz auf der aktuellen Produktion.</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance%2C+Physiology%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li>
<li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/EE/B816647A">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c0ee00260g">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron%28III%29+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlehtml/2009/ee/b816445b">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+biofilm+imaging%2C+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li>
<li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li>
<li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese%28IV%29+and+Iron%28III%29+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.light.t.u-tokyo.ac.jp/e/2015/12/10/sp2015-9/">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+and+physicobiology%22%5BJournal%5D)">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li>
<li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li>
<li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li>
<li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J+Physiol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li>
<li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071(2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li>
<li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677(2015).</li>
<li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616318898">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li>
<li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+Cr%28VI%29+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li>
<li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167701294900051">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li>
<li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li>
<li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li>
<li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0204794">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li>
<li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/celc.201402151/abstract">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.6b00349">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/14/116475">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Unsere ganze Zelle elektrochemischen Test hat einige technische Vorteile verglichen mit Protein Elektrochemie. Während Proteinreinigung mehrstufige zeitaufwändige Verfahren erfordert, dauert unsere gesamte-Cell-Methode einen Tag von selbstorganisierten Biofilmbildung nach Zellkultur. Um eine stabile Wechselwirkung zwischen OM czu erreichen - Cyts und der Elektrode, brauchen wir nur Sterilisation und Reinigung der Elektrodenoberfläche; Es erfordert keine Elektrode Modifikation für organisieren die Ausrichtung der...

Elektrochemische Techniken um ein Redox-Protein in einer intakten bakteriellen Zelle direkt zu charakterisieren sind seit der Entdeckung der Metall-reduzierende mikrobielle Belastungen, z. B. S. Oneidensis MR-1 oder Geobacter Sulfurreducens PCA vor kurzem entstanden, äußere Membran Cytochrom c-Typ-komplexe (OM c-Cyts) ausgesetzt, die Zelle außen1,2,3,4,5haben. Das OM cvermitteln - Cyts Elektronentransport aus der Atmungskette auf festen Untergründen befindet sich extrazellulär. Dieser Transport wird als extrazelluläre Elektronentransport (EET)1,6 bezeichnet und ist ein kritischer Prozess für neue Biotechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen-6. Daher, um die zugrunde liegenden EET-Kinetik und Mechanismen und seiner Verbindung zum mikrobielle Physiologie verstehen, OM c -Cyts wurden untersucht mit ganzen Zelle Elektrochemie4,7, kombiniert mit Mikroskopie 8 , 9, Spektroskopie10,11und Molekularbiologie2,4. Im Gegensatz dazu haben Methoden, um den Einfluss der EET-assoziierten kation Transport, z. B. Protonen, auf EET Kinetik in lebenden Zellen untersuchen kaum trotz PROTONENTRANSPORT über bakterielle Membranen haben eine entscheidende Rolle im festgestellt wurde, Signalisierung, Homöostase und Energie Produktion12,13,14. In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Technik, um die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT auf EET Kinetik in der S. Oneidensis MR-1 Zelle mit Hilfe von ganzen Zelle elektrochemischen Messungen, zu untersuchen, die die Identifikation der Bandbreitenbegrenzung Schritt erfordert mikrobielle aktuelle Produktion15.
Eine direkte Möglichkeit, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT auf die damit verbundenen EET zu bewerten ist der Deuterium-kinetische Isotop-Effekt (KIE). Die KIE ist zu beobachten, wie die Veränderung der Electron Transfer Kinetik auf den Ersatz von Protonen mit Deuterium-Ionen, der die Auswirkungen der PROTONENTRANSPORT Electron Transfer Kinetik16darstellt. Die Theorie der KIE selbst hat mit elektrochemischen Messungen mit gereinigtem Enzyme17gut etabliert. Jedoch da aktueller Produktion in S. Oneidensis MR-1 aus mehrere, unterschiedliche und schwankende Prozesse18, kann man einfach EET als die Bandbreitenbegrenzung Prozess nicht identifizieren. Um die KIE auf Proton Transportprozesse gepaart mit EET zu beobachten, müssen wir bestätigen, dass die mikrobiellen laufenden Produktion durch Elektronentransport durch OM cbegrenzt ist - Cyts an der Elektrode. Zu diesem Zweck haben wir die überstehende Lösung durch frisches Medium mit einer hohen Konzentration von Laktat als ein Elektron Spender an der optimalen pH und Temperaturbedingungen vor KIE Messung ersetzt; Dieser Ersatz diente zwei Rollen: (1) erhöht die Rate der vorgelagerten Stoffwechselprozesse im Vergleich zu den EET, und (2) ausgelassen die Zellen Schwimmen im überstand der Monolage Biofilm von S. Oneidensis MR-1 auf den arbeitenden Elektrode (befreit Indium-Zinn-dotierte oxid (ITO)-Elektrode). Die vorgestellte ausführliche Protokoll soll helfen neue Praktiker erhalten und bestätigen, dass die EET-Bestimmung Schritt erfolgt.

<table><tbody><tr><td>Glaszylinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Basis des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>wird</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Grundlage des elektrochemischen Reaktors verwendet wird</td></tr><tr><td>Hüttylkautschuk</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, eingefügt zwischen den einzelnen Komponenten des elektrochemischen Reaktors</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Wird als Injektionsöffnung einer elektrochemischen Reaktorelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Indiumzinn-dotiertes Oxid (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>Nr. 0001</td><td>Wird als Arbeitselektrode verwendet, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl gesättigte Elektrode</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Wird als Referenzelektrode verwendet, &Phi; 0,30 mm</td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>The Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Wird als Gegenelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Luria-Bertani (LB) Broth, Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Medium für die Vorkultivierung von S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Anthrachinon-1-sulfonat (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Flavin-Mononukleotid (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Wird für definiertes Medium (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 & Middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Wird für DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Verwendet für DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonsäure (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Verwendet für DM-Natriumlactatlösung</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Hefeextrakt</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid (D, 99,9 %)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Additiv für Experimente mit kinetischem Isotopeneffekt</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Wird für die Vorkultivierung</td></tr> verwendet <tr><td>Schüttler</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Wird für die Vorkultivierung</td></tr><tr><td>verwendet Autoklavenmaschine</td><td>TOMY SEIKO CO., LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Wird zur Sterilisation des elektrochemischen Reaktors und des Mediums verwendet</td></tr><tr><td>Reinbank</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Wird verwendet, um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors und des Mediums mit anderen Mikroben zu verhindern</td></tr><tr><td>Zentrifugenseparator</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Drehzahl bis zu 6000x; g wird benötigt</td></tr><tr><td>Stickstoffgasgenerator</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Stickstoffgasflasche kann auch anstelle des Gasgenerators verwendet werden</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektrometer</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Wird zur Optimierung der Zelldichte verwendet</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Wird für Biofilmbildung und Experimente mit kinetischen Isotopeneffekten verwendet</td></tr><tr><td>Thermalwasserzirkulator</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Wird zur Aufrechterhaltung der Temperatur des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Wird für elektrochemische Experimente verwendet</td></tr></tbody></table>

elektrochemische detektion von deuterium kinetische isotop effekt auf extrazelluläre elektronentransport in shewanella oneidensis mr-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direkte elektrochemische Detektion von c-Typ Cytochrom-komplexe, eingebettet in die äußeren bakterienmembran (äußere Membran c-Typ Cytochrom-komplexe; OM c- Cyts) hat vor kurzem erwies sich als eine neuartige ganze Zelle analytische Methode um den bakteriellen Elektronentransport aus der Atmungskette der Zelle äußeren zu charakterisieren, als die extrazelluläre Elektronentransport (EET) bezeichnet. Während der Weg und die Kinetik der Elektronenfluss während der EET Reaktion untersucht wurden, hat eine ganze Zelle elektrochemische Methode zu prüfen, die Auswirkungen des kation Verkehrs EET zugeordnet noch nicht etabliert. In der vorliegenden Studie wird ein Beispiel für eine biochemische Technik zu prüfen, die Deuterium kinetische Isotop Wirkung (KIE) auf EET durch OM c- Cyts mit einem Modell Mikrobe, Shewanella Oneidensis MR-1, beschrieben. Die KIE auf den EET-Prozess erhalten Sie EET durch OM c- Cyts fungiert als die Bandbreitenbegrenzung Schritt in der mikrobiellen laufenden Produktion. Zu diesem Zweck vor der Zugabe von D2O ersetzte die überstehende Lösung mit frischen Medium mit einer ausreichenden Menge an der Elektron-Spender, die Rate der vorgelagerten Stoffwechselreaktionen zu unterstützen und eine einheitliche planktonischen Zellen entfernen Monolage Biofilm an der Arbeitselektrode. Alternative Methoden zur Bestätigung die Bandbreitenbegrenzung Schritt mikrobielle laufende Produktion als EET durch OM c- Cyts werden ebenfalls beschrieben. Unsere Technik eines ganzen Zelle elektrochemische Assays für die Untersuchung von Proton Transport Kinetik kann auf andere Elektroaktive mikrobielle Belastungen angewendet werden.

Nach 25 h mögliche Anwendung auf + 0,4 V (gegen sie) bildete ein monomolekularen Film Biofilm auf die Arbeitselektrode ITO Glas, zuvor durch ein Rasterelektronenmikroskop oder einem konfokalen Mikroskopie4bestätigt wurde. Der repräsentative zeitliche Verlauf der aktuellen Produktion von S. Oneidensis MR-1 während einer Monoschicht Biofilmbildung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl der Strom in jeder Messung verändert, wird d...

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Beitrag des Protonentransports zur Rate des bakteriellen extrazellulären Elektronentransports durch den Nachweis des kinetischen Isotopeneffekts von Deuterium zu beobachten. Unsere Methode zeigt den Einfluss des Protonentransports auf die Kinetik des extrazellulären Elektronentransports (EET) von Bakterien zu einer Elektrode über c-Typ-Cytochrome der äußeren Membran. Unser Assay spiegelt das native Protonenmanagement bei der EET wider, da wir lebende Bakterien anstelle von gereinigten Enzymen verwendet haben.Unsere Herausforderung bestand jedoch darin, die Geräusche von anderen zellulären Prozessen zu entfernen. Der kinetische Isotopeneffekt von Deuterium, der als KIE bezeichnet wird, ist eine der besten Techniken, um den Beitrag des Protonentransports zum damit verbundenen Elektronentransportprozess zu untersuchen. Um Shewanella MR-1-Zellen zu züchten, überführen Sie eine Kolonie der auf einer Agarplatte gezüchteten Zellen in 15 Milliliter LB-Medium.Züchten Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen mit Schütteln bei 160 U/min. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang bei der 6.000-

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Research

Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Quelle: Tokunou, Y., et al., Elektrochemischer Nachweis des deuteriumkinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine elektrochemische Ganzzellmethode, um zu beurteilen, wie sich der Protonentransfer auf den extrazellulären Elektronentransport (EET) in elektroaktiven Bakterien auswirkt. Durch das Ersetzen von Protonen durch Deuteronen unter Verwendung von Deuteriumoxid misst die Methode...

Messung des kinetischen Isotopeneffekts auf den mikrobiellen Elektronentransport mit Hilfe von Deuteriumoxid

Quelle: Tokunou, Y. et al., Elektrochemische Detektion des Deuterium-kinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert den Zusammenbau und Betrieb eines elektrochemischen Reaktormodells, das zur Simulation der Biofilmbildung auf Elektrodenoberflächen entwickelt wurde. Kontrollierte elektrochemische Stimulation fördert die mikrobielle Adhäsion, was zur allmählichen Entwicklung eines bakteriellen...

Entwicklung eines bakteriellen Monoschicht-Biofilms mit einem elektrochemischen Reaktor

Exosomen sind mikrovesikuläre Strukturen, die in Bioflüssigkeiten vorkommen und möglicherweise wichtige krankheitsdiskriminierende Biomarker tragen. Hier wird eine neuartige Methode verwendet, um Exosomen spezifisch zu extrahieren und die exosomale Fracht für beide RNA/Protein-Ziele nach dem Aufschluss von Exosomen mit ungleichmäßigen elektrischen zyklischen Rechteckwellen schnell zu testen.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Vor-Ort-mikrobielle Bereicherung oder in Situ Anbautechniken können die Isolierung der mikrobiellen Taxa schwierig zu Kultur, vor allem von Low-Biomasse oder geochemisch extreme Umgebungen erleichtern. Hier beschreiben wir eine elektrochemische Einrichtung ohne eine externe Stromquelle, um mikrobielle Belastungen zu bereichern, die extrazelluläre Elektronentransport (EET) geeignet sind.

Selbststehende elektrochemischen Aufbau Anode atmender Bakterien vor Ort zu bereichern

Dieses Protokoll stellt einen schnellen Test auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) innerhalb von 2,5 h durch einzelzellstimulierte Raman-Streubildgebung desD2O-Metabolismusdar. Diese Methode gilt für Bakterien im Urin oder Vollblut, was für eine schnelle einzellige phänotypische AST in der Klinik transformativ ist.

Schnelle antimikrobielle Empfindlichkeitstests durch stimulierte Raman-Streubildgebung des Deuteriumeinbaus in ein einzelnes Bakterium

Hier stellen wir ein Protokoll zur Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers (EET) in Milchsäurebakterien unter Verwendung eines bioelektrochemischen Systems mit drei Elektroden und zwei Kammern vor. Wir veranschaulichen diese Methode mit Lactiplantibacillus plantarum und dem Redoxmediator 1,4-Dihydroxy-2-naphthoinsäure und geben eine ausführliche Beschreibung der elektrochemischen Techniken, die zur Evaluierung der vermittelten EET verwendet werden.

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

Hier stellen wir ein Protokoll für die Verwendung von organischen elektrochemischen Transistoren (OECTs) vor, um die Aktivität des extrazellulären Elektronentransfers (EET) in Shewanella oneidensis in elektrische Signale zu übersetzen. Das hybride OECT-System bietet eine verbesserte Robustheit, Empfindlichkeit und das Potenzial für schnelle Tests mit hohem Durchsatz, was es zu einem effektiven Werkzeug für EET-Messungen macht.

Translation extrazellulärer Elektronentransferaktivitäten mit organischen elektrochemischen Transistoren

Erfahren Sie die elektrochemische Detektion des Deuterium-Kinetik-Isotopeneffekts bei Shewanella oneidensis MR-1. Diese Methode untersucht den Protonentransport im extrazellulären Elektronentransport lebender Bakterien.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

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