Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der bispezifischen Antikörper zu beantworten, z. B. wie man einen bispezifischen Antikörper in Bakterien herstellt und die Funktion des gereinigten Antikörpers bestimmt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass GPC3-S-Fab leicht hergestellt und aus E.coli gereinigt werden kann. Zur Herstellung der periplasmatischen Fraktion zentrifugiert man zunächst die Zellsuspension bei 4.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Stoßen Sie dann das Medium aus und wiegen Sie die Zellen. Nach der Zentrifugation lösen Sie das Zellpellet in vier Millilitern eiskalter Saccharoselösung pro Gramm Zellen auf. Inkubieren Sie die Zellsuspension 15 Minuten lang auf Eis.

Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 8.500 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Pipettieren Sie dann den Überstand mit der Saccharosefraktion heraus und lagern Sie ihn auf Eis. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einer eiskalten Mischung aus fünf Millimolar Magnesiumchlorid und einem Millimolar PMSF.

Geben Sie dann 40 Mikroliter à 15 Milligramm pro Milliliter des Lysosomenstocks in die Zellsuspension. Lassen Sie die Zellsuspension nach Zugabe des Lysosomenstocks 30 Minuten lang auf Eis. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Saccharose und die periplasmatische Fraktion kombiniert.

Dann zentrifugieren Sie die Saccharose-Periplasma-Fraktion bei 30.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Beendigung der Zentrifugation wird der Überstand in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis übertragen. Als nächstes wird ein Milliliter Nickel-NTA-Agarose mit dem Überstand gemischt und resuspendiert, um eine homogene Suspension zu erhalten, dann ein Milliliter Nickel-NTA-Agarose in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Zu der Agarose fügen Sie 10 Spaltenvolumina des Äquilibrierungspuffers hinzu. Dann zentrifugieren Sie die Agarose bei 400 g fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig entfernen und die Nickel-NTA-Agarose zur Saccharose-Periplasma-Fraktion hinzufügen.

Schütteln Sie dann das Röhrchen, das die Saccharose-Periplasma-Fraktion enthält, zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Mischung erneut. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand zu einem frischen eiskalten Röhrchen, da dies die ungebundene Fraktion ist.

Nachdem der Überstand übertragen wurde, wird das Nickel-NTA-Agarose in die Schwerkraftsäule gegeben. Fügen Sie dann der Spalte drei Spaltenvolumina Elutionspuffer hinzu. Sammeln Sie als Nächstes das Eluat als Elutionsfraktionen eins, zwei, drei bzw. vier.

5.000 Zellen in 100 Mikrolitern in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte verdünnen und aussäen. Inkubieren Sie die Platte sechs bis acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um sie zu befestigen. Zur Herstellung der PBMCs verdünnen Sie zunächst das frisch zubereitete Blut mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Pipettieren Sie 15 Milliliter Lymphozytentrennmedium in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie anschließend das verdünnte Blut vorsichtig entlang der Wände des Schlauchs in das Lymphozytentrennmedium. Die Zellen werden bei 400 g 35 Minuten lang bei Raumtemperatur bei ausgeschalteten Bremsen zentrifugiert.

Ziehen Sie nach der Zentrifugation die obere Plasmaschicht vorsichtig heraus. Dann pipettieren Sie die weiße Blutschicht, die die PBMC enthält. Verdünnen Sie diese erhaltenen PBMCs mit dem doppelten Volumen an phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2 % fötalem Rinderserum.

Zentrifugieren Sie dann die PBMC-Suspension. Waschen Sie das Zellpellet mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2 % fötalem Rinderserum und zentrifugieren Sie erneut. Zählen Sie nach der Zentrifugation die Zellzahl.

Um die natürlichen Killerzellen vorzubereiten, rekonstituieren Sie die PBMCs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 2 % fötaler Rindersalzlösung. Füllen Sie dann die Mischung in ein Polystyrol-Rundbodenröhrchen um. Fügen Sie der PBMC-Mischung 50 Mikroliter pro Milliliter des natürlichen Killerzellanreicherungscocktails hinzu.

Mischen Sie den Inhalt und lassen Sie die Tube 10 Minuten lang stehen. Als nächstes werden die im Anreicherungscocktail vorhandenen magnetischen Partikel durch mehrmaliges Pipettieren resuspendiert und gemischt, so dass die Partikel gleichmäßig suspendiert werden. Fügen Sie dann 100 Mikroliter pro Milliliter magnetischer Partikel zur Zellsuspension hinzu.

Mischen Sie die magnetischen Partikel der Zellsuspension und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten fügen Sie der Zellsuspension 2,5 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 2 % fötalem Rinderserum hinzu. Pipettieren Sie vorsichtig zwei- bis dreimal, um die Zellen im Röhrchen zu mischen.

Setzen Sie das Rohr auf den Magneten und lassen Sie die Magnetperlen 2,5 Minuten lang bei Raumtemperatur einwirken. Dann drehen Sie das Röhrchen mit einem einzigen Arbeitsgang um und gießen Sie die angereicherte Zellsuspension in ein neues Röhrchen. Zählen Sie erneut die Anzahl der Zellen.

Sobald die Zählung abgeschlossen ist, verdünnen Sie die natürlichen Killerzellen im Kulturmedium. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Zellsuspension zu den Tumorzellen, die in einer 96-Well-Platte plattiert sind. Um die Zytotoxizitätsassays einzurichten, geben Sie 10 Mikroliter mit unterschiedlichen Konzentrationen des GPC3-S-Fab-Antikörpers in die 96-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Platte dann 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der angegebenen Inkubationszeit wird das Medium abgesaugt. Geben Sie dann 100 Mikroliter DMEM-Medium mit 10 Mikrolitern CCK-Reagenz in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.

Inkubieren Sie die Platte wieder bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Platte jede aufeinanderfolgende Stunde bis vier Stunden nach der Zugabe des CCK8-Reagenzes bei 450 Nanometern abgelesen. Der GPC3-S-Fab-Antikörper wird durch eine zweistufige Affinitätsreinigung aufgereinigt.

Hier zeigen die beiden Panels, dass der Antikörper mit den Nickel-NTA-Agarose- bzw. den IgG-CH1-Affinitätsaufreinigungssäulen aufgereinigt wird. Anschließend wird die Bindungsaffinität des GPC3-S-Fab-Antikörpers anhand von GPC3-positiven und -negativen Krebszelllinien untersucht. Der GPC3-S-Fab bindet an alle GPC3-positiven Zellen wie Hep3B, Huh7, Hep2G und CHO/GPC3.

Interessanterweise wird keine oder nur eine minimale Bindung beobachtet, wenn GPC3-negative Zellen wie MHCC-97H und CHO verwendet werden. Die Zytotoxizität des GPC3-S-Fab wird auch in Gegenwart von Tumorzellen untersucht, die mit frischen natürlichen Killerzellen inkubiert sind. Der Antikörper GPC3-S-Fab löst in Gegenwart der natürlichen Killerzellen dosisabhängig eine starke Zytotoxizität gegen HepG2-, Hep3B- und Huh7-Zellen aus.

Eine solche Zytotoxizität wird jedoch in Abwesenheit der natürlichen Killerzellen auf den MHCC-97H-Zellen nicht beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte auf Eis zu halten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Xenotransplantatmodellierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. bei der Tumorwirkung in vivo. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der bispezifischen Antikörper, um Antitumorwirkungen in vitro zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen funktionellen bispezifischen Antikörper herstellt, der auf die Tumorzellen abzielt, insbesondere die Isolierung der NK-Zellen.