Name: A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, Aβ oligomerlerinin sentetik peptitten hazırlanması ve dot blot analiziyle miktarlarının değerlendirilmesi yöntemini. Bu basit ve güvenilir protokol, nörofarmakolojik araştırmalar için temel bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (U1503223, 81673407, 21475131), kar amacı gütmeyen teknoloji Zhejiang Eyaleti (2016 C 37110), Ningbo uluslararası bilim ve teknoloji üzerinde uygulamalı araştırma projesi hibe tarafından desteklenmiştir İşbirliği projesi (2014D 10019), yaşam bilimleri ve sağlık (2015C 110026), Ningbo bilim ve teknoloji proje yaygın zenginlik (2017C 50042), Li Dak toplamı Yip Yio çene Kenneth Li Marine biyofarmasotik Kalkınma Fonu için Ningbo Belediye yenilik ekibinin, ve Ningbo Üniversitesi'nde K. C. Wong Magna fonu.

1. çözüm hazırlık
Not: Tablo malzemeleri reaktif kaynakları için bakın.
<ol><li>%5 Sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 5 g çift distile su 100 mL için eklemek suretiyle hazırlamak. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-oligomer antikor A11 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-Aβ antikor 6E10 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-fibriler oligomer antikor OC çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hisse senedi çözüm 24 g Tris tabanının ve 88 gr NaCl 1000 mL için çift distile su ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlayın. Çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Tris arabelleğe alınmış serum ve ara-20 (TBST) çözüm ara-20 1 mL 100 mL TBS ekleyerek hisse senedi çözüm ve 900 mL çift distile su hazırlamak.</li>
	<li>Bir ikincil antikor çözüm horseradish ekleyerek 10 µL tarafından peroksidaz (HRP) keçi Anti-tavşan IgG (H + L) 10 mL TBST çözeltisi için hazır olun. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Curcumin dimetil sülfoksit (10 mM curcumin hisse senedi çözüm oluşturmak için DMSO) 1 ml 3.68 g geçiyoruz.</li>
	<li>Sentetik Aβ1-42 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (2.5-mg/mL Aβ monomer çözüm oluşturmak için HFIP) 2 ml 5 mg geçiyoruz. 20 dk. yapmak 100 µL aliquots için oda sıcaklığında (25 ° C) yerleştirin ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın. Not: Bu yordam kısa sürede çalıştırılması gerekir. Pipet ipuçları doğru pipetting emin olmak için kesilmiş.</li>
	<li>Electrochemiluminescence (ECL) sıvı hacim oranı 1:1 ECL sıvı A ve B karıştırarak hazırlayın. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. numune hazırlama
Not: 2 gün önce analiz kurutma nokta numune hazırlama gerçekleştirin.
<ol><li>Çift distile su 900 µL Aβ1-42 monomer çözüm bir tüp için ekleyin; Aβ1-42 konsantrasyonu 0.25 mg/mL olacaktır. 20 dakika oda sıcaklığında karışımı yerleştirin.</li>
	<li>Hacmi yaklaşık 850 µL olana yüksek saflıkta azot gazı ile çözüm buharlaşır. Aβ1-42 çözüm konsantrasyonu 0.29 mg/mL hakkında olacak. Not: Çözüm zaman zaman HFIP tamamen buharlaşıp emin olmak için sarsılmış. Normalde, buharlaşma, 30 dk sonra kalan çözüm yaklaşık 850 µL birimdir.</li>
	<li>Curcumin hisse senedi çözüm curcumin çalışan bir çözüm (0.2 ve 2 µM) çift distile suyla seyreltik. Aβ1-42çözüm ve çözüm 1:1 bir hacim oranı ile çalışma curcumin karıştırın. Curcumin son konsantrasyonları 0,1 ve 1 µM. Not: Potansiyel oligomer inhibitörleri Aβ1-42 çözüm gerekirse herhangi bir oranda ile karışabilir.</li>
	<li>Çözüm, sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı sallamak ( Tablo malzemelerigörmek).<ol>
<li>Manyetik karıştırıcı bir plastik ayırıcı kutusuna düzeltmek. Place 2 manyetik barlar kutusunun 2 köşesine heyecan ve örnek tüpler kutusunun ortasına yerleştirin.</li>
		<li>Kutusu, oda sıcaklığında (25 ° C) 48 h için salla. Not: Manyetik karıştırıcı hızını yaklaşık 60 rpm olduğunu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C'de 15 dakika tüpler santrifüj kapasitesi ve 18.000 x g. süpernatant toplamak.</li>
</ol>3. dot blot Analizi
Not: Tüm incubations üzerinde yatay bir shaker gerçekleştirilir.
<ol><li>Nitroselüloz membran 1 cm genişliğinde şeritler halinde kesin. Not: Nitroselüloz membran genişliğini deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.</li>
	<li>2-µL örnekleri eşit 2 şeritler (şerit 1 ve 2) 0.5 cm her noktası Aralık ile yerleştirin.</li>
	<li>Damlacık grup üzerinde kuru olana, oda sıcaklığında 5 min için şeritler yerleştirin.</li>
	<li>Şeritler, oda sıcaklığında 30 dk için %5 BSA çözüm ile kuluçkaya.</li>
	<li>Şeritler ile bir TBST çözüm 5 min için oda sıcaklığında durulayın.</li>
	<li>TBST çözüm Aspire edin. 1 h, oda sıcaklığında için şerit bir anti-oligomer antikor A11 çözüm 1 kuluçkaya ve 2 anti-Aβ antikor 6E10 çözümünü ile şerit.</li>
	<li>Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.</li>
	<li>TBST çözüm Aspire edin. Şeritler, oda sıcaklığında 40 min için bir ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.</li>
	<li>Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.</li>
	<li>Eşit karma ECL sıvı şeritler yüzey için geçerlidir. Şeritler görüntüleme sistemi bir otomatik Kemiluminesan maruz ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Normalde, ECL sıvı 300 µL bir membran yeter. Membran pozlama sırasında nemli tutulmalıdır. Pozlama süresi görüntüleme sistem tarafından otomatik olarak hesaplanır.</li>
	<li>Yarı kantitatif sonuçları elde etmek için ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) veya başka bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bir gri tonlamalı analizi yapmak.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için bir yöntem Aβ1-42 oligomer içeren numune hazırlama ve analiz kurutma bir nokta tarafından A11-pozitif Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlemek için bildirdin. Bizim yöntemleri Aβ1-42 oligomer zengini örnekleri hazırlanması için oldukça basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, hala fark gereken bazı noktalar vardır. İlk olarak, HFIP sentetik Aβ1-42 peptid dağıtmak için kullanılır. Bir araya getirilmiş Aβ1-42 peptid monomer HFIP çözüm içine sök...

Alzheimer hastalığı (Ah) yaşlı insanlar dünya çapında1etkileyen en önemli nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. β-amiloid (Aβ) anormal toplama reklam önde gelen patolojik etken olabilir yaygın olarak kabul edilir. Aβ toplamları Senil plakalar, bir reklam hastaların beyinlerinin biyolojik işaretleri ana bileşenleri vardır. Ayrıca, Aβ toplamları reaksiyonlar özellikle de dahil olmak üzere, reklam ilerledikçe nöronal ölüm sebebi olabilir güçlü nörotoksisite üretmek. Bu nedenle, Aβ oligomer oluşumu inhibisyonu ateş engelleyebilir ve Aβ oligomer inhibitörleri-var geliştirilen hastalığı olarak değiştirme AD tedaviler. Birçok çalışma sentetik Aβ peptid reaksiyonlar içinde vitroformu, türleri Morfoloji ve yapay Aβ reaksiyonlar yapıları keşfetmek ve vitro modelleri2,3 kullanarak Aβ oligomer inhibitörleri araştırmak için kullanılan , 4. ancak, farklı vitro oluşumu protokolleri Aβ oligomer oligomer farklı araştırma grupları arasında eşsiz sonuçlar neden olabilir farklı morfolojik özelliklere sahip yol açabilir. Bu nedenle, bir standart oluşumu protokol Aβ oligomer için acilen ihtiyacı vardı.
Şimdiye kadar çoğu yöntemleri doğrudan Aβ reaksiyonlar algılamak için rapor edilmiştir. İletim elektronik mikroskobu (TEM), Sigara denaturing Jel Elektroforez, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve dot blot Analizi miktar ve/veya morfolojisi Aβ oligomer vitro5, incelemek için kullanılabilir 6. Örneğin, Morfoloji ve Aβ oligomer yapısını TEM içinde görülebilir. Göreli tutarları ve moleküler boyutu Aβ toplamalardan sigara denaturing jel elektroforez tarafından ölçülen. ELISA Aβ oligomer serum, plazma ve beyin dokusu özler belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, dot blot analizi, algılamak için kullanılan bir teknik analiz ve proteinler, tanımlama Aβ oligomer farklı örneklerinde göreli yoğunlaşmasını oligomer ve Aβ özgü antikorlar yardımıyla değerlendirmek için kullanılabilir. Jel Elektroforez ve blotting yordamları jeller için gerekli değildir Ayrıca, tahlil kurutma bir nokta önemli zaman tasarrufu sunuyor. Bu nedenle, bu tahlil normalde ekran potansiyel Aβ oligomer inhibitörleri kullanılır. Bu iletişim kuralı genel amacı dot blot Analizi ve ekran Aβ oligomer Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlenecek bir Aβ1-42 oligomer zengini örnek, hazırlamak için nispeten basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif etmektir Yarı kantitatif deneysel sonuçlar kullanarak inhibitörleri.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb ila Amiloid Oligomerleri)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (beta-Amiloid Tavşan Ab)</td><td>Hücre&nbsp; Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amiloid Fibriller OC Antikoru)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) İşaretleyici Keçi anti tavşan IgG (H + L) &nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A ve beta; 1-42< / sub</td><td>>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albümin Sığır V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Dimetil sülfoksit</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5 kez; denatüre olmayan jel PAGE Protein Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Saf Nitroselüloz Blotting Membran</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Süper düşük aralık&nbsp; protein Marker</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Membranları</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Hızlı boyama çözümü</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>Hepsi otomatik kemilüminesans görüntüleme sistemi</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Sağlık</td><td></td><td></td>Enstitüleri</tr><tr><td>Görüntü işleme yazılımı</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı</td><td>Şangay Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-pozitif β-amiloid oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak dot blot analizi

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-amiloid (Aβ) kendi kendine toplamları birleştirmek için içsel bir eğilim ile hidrofobik bir peptit var. Çeşitli toplamları arasında Aβ oligomer yaygın olarak Alzheimer hastalığı (Ah) devam eden önde gelen nörotoksin olarak kabul edilir ve reklam patogenezinde önemli olay olarak kabul edilir. Bu nedenle, Aβ oligomer inhibitörleri ateş önlemek ve hastalık değiştirme olarak geliştirilecek potansiyeline sahip reklam tedaviler. Ancak, farklı oluşumu protokollerin Aβ oligomer reaksiyonlar farklı özelliklere sahip yol açabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde ekran Aβ1-42 oligomer inhibitörleri için pek çok yöntem değildir. A11 almışlarsa bir alt kümesiyle toksik Aβ1-42 oligomer Anti-paralel β-sayfa yapıları ile tepki verebilir. Bu protokol için biz nasıl bir sentetik Aβ1-42 peptid vitro bir A11-pozitif Aβ1-42 oligomer zengini örnekten hazırlamak için ve dot blot tarafından göreli A11-pozitif Aβ1-42 oligomer örneklerinde miktarda değerlendirmek için tarif analiz A11 ve Aβ1-42-belirli 6E10 antikorlar. Bu iletişim kuralını kullanan, A11-pozitif Aβ1-42 oligomer inhibitörleri de yarı kantitatif deneysel sonuçlar ekranlı.

Aβ1-42 monomer hazırlık sonra bir Aβ1-42 oligomer oluşturmak olup olmadığını araştırmak için TEM analizi kullanıldı. Hiçbir görünür toplamları HFIP çözünmüş Aβ1-42 monomer örnek (Şekil 1A) tespit edildi. Ayrıca, esas olarak küresel toplamları çapında 10-80 nm gözlendi Aβ1-42 örnekte sallayarak, 48 saat sonra Aβ1-42 reaksiyonlar hazırlık (Şekil 1B</str...

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Bu yöntem, nörofarmakolojik alandaki temel soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, beta-amiloid oligomer oluşturmak için basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. Beta oligomer hazırlama adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin gösterilmesinin kritik olduğunu gösteriyoruz.İlk olarak, tüpe 900 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyerek A-beta monomer çözeltisinin konsantrasyonunu mililitre başına 0.25 miligrama ayarlayın. Daha sonra, monomer çözeltisini yüksek saflıkta nitrojen gazı ile buharlaştırmaya devam edin, hacim mililitre başına yaklaşık 0.29 miligram konsantrasyonla yaklaşık 850 mikrolitreye ulaşana kadar. HR5P'nin varlığı, A-beta oligomerinin oluşumunu etkiler.Bu nedenle, mümkün olduğu kadar buharlaştırmak bu prosedürün kritik bir adımıdır. Daha sonra, 0.2 ve iki mikromolar çalışma çözeltisi hazırlamak için kurkumin stok çözeltisini seyreltmek için çift damıtılmış su kullanın. Bire bir oranını koruyun ve 0.1 ve bir mikromolar'da nihai kurkumin konsantrasyonunu elde etmek için A-beta çözeltisini kurkumin ile karıştırın.Ardından, çözeltiyi manyetik bir karıştırıcı üzerinde bırakın. Manyetik karıştırıcıya plastik bir bölücü kutu takın. Kutunun iki köşesine iki manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin, ardından tüpleri numunelerle birlikte kutunun ortasına yerleştirin.Kutuyu oda sıcaklığında dakikada 60 devirde 48 saat çalkalamaya devam edin, ardından tüpü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı toplayın. Nokta lekeleme analizi için, bir nitroselüloz membran alın ve bir santimetre genişliğinde şeritler halinde kesin, ardından numunenin iki mikrolitresini, her nokta aralığı 0,5 santimetre olacak şekilde bir ve iki şeritlerin üzerine eşit şekilde yerleştirin.Numuneyi membran üzerine püskürtülürken, eşit şekilde yayılmak ve farklı damlacıkların kontrol edilmesi gerekir, böylece farklı numuneler birbirine bağlanmaz. Daha sonra, damlacıkların kuruması için şeritleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, şeritleri oda sıcaklığında% 5 sığır serum albümini ile 30 dakika inkübe edin.İnkübasyon bittiğinde, şeritleri TBST tamponu ile beş dakika yıkayın. Yıkama yapıldıktan sonra tamponu aspire edin, ardından bir şeridi anti-oligomer antikoru A11 ile inkübe edin ve ikinci şeridi anti-A-beta antikoru 6E10 solüsyonu ile bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, şeritleri TBST ile her üç kez beş dakika boyunca yıkayın, daha sonra tamponu aspire edin ve şeritleri 40 dakika boyunca ikincil antikor çözeltisi ile inkübe edin.İkincil antikor inkübasyonundan sonra, şeritleri her üç kez beş dakika boyunca TBST ile tekrar yıkayın. Ardından, nemli şeritlerin yüzeyine yaklaşık 300 mikrolitre karışık ECL sıvısı ekleyin, ardından şeritleri otomatik bir kemilüminesans görüntüleme sisteminde açığa çıkarın. TEM çalışmaları, HFIP ile çözünmüş A-beta monomer çözeltisinde herhangi bir görünür agreganın olmadığını göstermektedir, ancak 48 saatlik inkübasyondan sonra, aynı monomer, esas olarak 10 ila 80 nanometre çapında küresel agregalar olan oligomerleri oluşturur.A-beta monomer ve oligomerden zengin numuneler nokta leke analizine tabi tutulduğunda, A-beta oligomerden zengin numunelerde A11 pozitif A-beta oligomerlerinin varlığını gösterir. İlginç bir şekilde, A-beta 6E10 pozitif A-beta peptitleri hem A-beta monomerinde hem de oligomer açısından zengin örneklerde bulunur. Daha sonra, spesifik antikor pozitif A-beta monomer ve oligomer açısından zengin numuneleri kontrol yüzdesi olarak ifade etmek için yarı kantitatif analiz de yapılır.A11 pozitif A-beta peptitler, A-beta oligomer açısından zengin örneklerde monomerlere kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Aksine, A-beta 6E10 pozitif A-beta peptit hem monomer hem de oligomer açısından zengin örneklerde bulunur. Aslında, A-beta oligomerleri ayrıca kurkumin ve A-beta oligomer inhibitörü ile birlikte inkübe edilir.Kurkumin, kurkumin ile birlikte inkübe edilmiş A-beta oligomer örneklerinde azalmış A11 boyaması ile A11 pozitif A-beta oligomerinin nispi miktarında önemli bir azalmaya yol açar. Bununla birlikte, değişen kurkumin konsantrasyonları, A11 pozitif numunelerle karşılaştırıldığında, 6E10 pozitif monomer ve oligomer açısından zengin numunelerdeki A-beta peptitlerinin sayısını etkilemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik araştırmacıların Alzheimer Hastalığı gibi nörodejeneratif bozukluklar için ilaç adaylarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, A-beta oligomerinin nasıl hazırlanacağını ve miktarını nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

SDD-YAŞ hücrelerde polimerler gibi amiloid algılama ve karakterizasyonu için yararlı bir tekniktir. Burada, bu tekniğin büyük ölçekli uygulamalarda mükellef kılar bir uyum göstermektedir.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Biz insan kortikal homojenatlarında açıklık, SDS-PAGE ile protein ayırma, antijen alımı ve Aβ peptid antikor immunoblotting hazırlanması için kullanılan bir tekniktir açıklar. Bu protokolü kullanarak, biz sürekli olarak insanlarda Alzheimer patolojisi olan kortikal doku monomerik ve multimer Aβ algılar.

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Amiloid beta-Protein, Alzheimer hastalığının etkeni Aptamers Seçimi

Bu video, amiloid liflerinin iki boyutlu yarı denatüre edici deterjan agaroz jel elektroforezi bazlı ayrımını göstermektedir. Teknik, polimorfik amiloid agregatlarını heterojen boyutlarına göre ayırır.

İki Boyutlu Yarı Denatüre Edici Agaroz Jel Elektroforezi: Polimorfik Amiloid Liflerini Boyut Heterojenliğine Göre Ayırmak İçin Bir Teknik

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Atomik kuvvet mikroskobunu biyopanlama teknolojisi ile birlikte kullanarak, düşük konsantrasyonlarda bile herhangi bir biyolojik materyalde bulunan hastalığa özgü protein varyantlarına karşı antikorlar elde etmek için negatif ve pozitif bir biyopanlama sistemi oluşturduk.  Amyotrofik Lateral Sklerozda rol oynayan TDP-43 protein varyantlarına karşı antikor elde etmede başarılı olduk.

Amyotrofik Lateral Skleroz TDP-43 Türevleri karşı Morfoloji Özel Reaktifler İzolasyonunda Roman Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı biopanning

Basit yöntem pulmoner endotel enfeksiyonu takip sitotoksik amyloids üretimini gösteren için Pseudomonas aeruginosatarafından açıklanmıştır.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Kütle spektrometrisine dayalı proteomik analiz ile bu biyokimyasal saflaştırma yöntemi, Alzheimer hastalığını önleme hedeflerinin belirlenmesini hızlandırabilecek amiloid fibril çekirdeklerinin sağlam karakterizasyonunu kolaylaştırır.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Burada, nokta blot kullanarak küresel m⁶A seviyelerini yarı nicel olarak değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Toplam RNA çıkarılır, denatüre edilir, naylon zar üzerinde lekelenir, anti-m⁶A antikoru ile incelenir ve kemilyümüsans ile görselleştirilir. Sinyal yoğunluğu, ImageJ gri tonlama analiziyle ölçülür, göreli metil bolluğunu yansıtır ve araştırma için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar.

Küresel N 6-metiladenosin RNA modifikasyon seviyelerini tespit etmek için nokta lekesi testi

Öğrenin, Aβ oligomerlerinin sentetik peptitten hazırlanması ve dot blot analiziyle miktarlarının değerlendirilmesi yöntemini. Bu basit ve güvenilir protokol, nörofarmakolojik araştırmalar için temel bir araçtır.

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

Daha fazla video keşfet