利用生物测定引导分馏法鉴定海洋鳗信息素

这种方法可以帮助回答化学生态学领域的关键问题，例如信息素的鉴定。这种技术的主要优点是它将新化合物与信息素功能联系起来。要开始此过程，请将 15-30 只性成熟的雄性七鳃鳗放入装有 250 升充气休伦湖水的水箱中，保持在 16-18 摄氏度。

要通过固相萃取提取调节后的水，请通过泵送系统将其从水箱中输送到塔的顶部。水流经一个由两公斤重的中等极性聚合物离子交换树脂组成的床，该树脂包含在一系列四个 1 升容量的玻璃柱中。接下来，去除有机溶剂，并在 40 摄氏度的减压下旋转蒸发 5 小时，收获提取物。

要分离馏分池，请将硅胶在初始流动相中浸泡 30 分钟。将含有溶剂的凝胶转移到玻璃柱中，然后打开其阀门，让流动相通过。接下来，将提取物与硅胶充分混合，然后将它们加载到硅胶床上方的液相色谱柱中。

用从 95% 氯仿到甲醇到 100% 甲醇的梯度洗脱它们，得到总共 2.5 升，然后将洗脱液收集在单个 10 毫升小瓶中。随后，通过在起跑线上施加样品并将板的起跑线浸入密封玻璃罐中的显影溶剂中，在预涂硅胶板上进行 TLC 实验。显影溶剂到达终点线后，将板从槽中取出，等待 10 分钟，让溶剂蒸发。

首先在 254 纳米的紫外光下观察斑点，然后使用色谱喷雾器用 5% 茴香醛的酸性甲醇溶液喷洒板，并在 85 摄氏度下加热 3 分钟，对板进行染色。然后，通过在 40 摄氏度的减压下旋转蒸发约 30 分钟，将馏分浓缩为残留物。要进行 EOG 记录，请使用微量移液器用三摩尔氯化钾填充用银 - 氯化银颗粒预制的极化毛细管电极和固态电极支架。

然后，将带电极的电极插入电极支架中。接下来，在容量瓶中的去离子水中，从 10 至负 2 摩尔 L-精氨酸储备液，在木炭过滤水中制备 100 毫升 10 至负 5 摩尔 L-精氨酸储备液。对于浓度响应曲线，制备 10 mL 10 倍稀释的馏分池。

现在，将麻醉的七鳃鳗放在 V 形支架上，并用湿纸巾包裹以防止干燥。将一管含有 50 毫克/升 MS222 的再循环充气水插入颊腔。调整流速并确保水通过鳃口流出，以持续灌溉鳃。

用过滤水冲洗加臭剂输送管，并将其连接到安装在显微作器上的阀门。接下来，将加臭剂输送毛细管放入嗅觉上皮腔中，将过滤后的水输送到嗅觉上皮，以防止在不施用加臭剂时干燥。然后，将记录电极和参比电极安装在显微作器上。

将参比电极降低到鼻孔附近的外部皮肤上。使用立体显微镜，降低记录电极，几乎不接触嗅觉上皮的表面。随后，将加臭剂输送管的吸收从背景过滤水中转移到 10 至负 5 摩尔的 L-精氨酸溶液中。

打开计算机、放大器、过滤器和数字化器。使用阀门驱动程序软件，通过选中 T1 框，将 T 设置为 4 秒，然后选中 T2.In 数据采集软件的框，将采集模式设置为高速示波器，对程序进行编程以管理四秒单脉冲加臭剂。单击 Play 图标，然后单击阀门驱动器中的 Start 以触发加臭剂脉冲。

开始记录空白对照 L-精氨酸，然后记录从低浓度到高浓度的加臭剂，并在两次应用之间冲洗过滤水 2 分钟。为了识别行为活跃的部分，将性成熟的雌性海七鳃鳗放在迷宫的释放笼中驯化五分钟。释放海七鳃鳗并记录七鳃鳗在实验通道和对照通道中花费 10 分钟的累积时间，每个通道都包含河水。

接下来，使用蠕动泵以每分钟 200 毫升的恒定速率将测试刺激施加到车辆中随机分配的实验通道到控制通道，持续 5 分钟，然后在车辆中再施加测试刺激 10 分钟，并记录七鳃鳗在实验和控制通道中花费的累积时间。在此过程中，使用 sephadex LH-20 色谱柱通过尺寸排阻色谱将活性级分进一步纯化成化合物。用 0.5 mL 初始流动相制备样品，将其加载到氯仿-甲醇柱中，然后上样到甲醇柱中，然后洗脱活性组分以得到化合物。

在 HPLC 的初始流动相中溶解并稀释纯化的化合物，形成约 1 μg/mL 的 10 μL 溶液。接下来，将样品溶液转移到 HPLC 样品瓶中，并将其放入 HPLC 的自动进样器中。将样品注入电喷雾电离质谱仪中，并使用色谱质谱仪记录高分辨率电喷雾电离质谱仪。

将样品完全溶解在选定的氘代溶剂中，形成浓度约为 0.1 至 10 毫克/毫升的溶液。将样品溶液转移到 NMR 管中，以在 900 兆赫兹 NMR 波谱仪上记录 1D 和 2D NMR 波谱。这里显示的是一台 600 兆赫兹的 NMR 波谱仪。

鉴定了 5 种新的推定海七鳃鳗信息素，并用光谱和光谱方法阐明了它们的结构。这些推定的信息素对成年海七鳃鳗嗅觉上皮具有刺激性，并且在电嗅觉图记录中具有较低的检测阈值。在两项选择迷宫行为测定中，排卵的雌性海七鳃鳗被 Petromyzone A、Petromyzene A 和 Petromyzene B 吸引，并被 Petromyzone C 排斥。

按照此程序，可以执行其他方法，如 X 射线晶体学和衍生化反应，以回答其他问题，例如化合物的立体化学。发展之后，这项技术为天然产物和神经行为学领域的研究人员探索海七鳃鳗等水生生物中信息素的合理生物合成和生物学功能铺平了道路。不要忘记，使用氯仿可能非常危险，在处理此试剂时应始终采取预防措施，例如在化学罩中工作、戴手套和护目镜。