Name: הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: למדו שיטה להנדסת רקמות רשתית מ-RPE נגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ממברנות שפיר אמניות. הטכניקה מאפשרת הכנת רקמה לשתל בעין ומספקת בסיס למחקר טיפולים רטינליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות ג'רום Larghero, ואלרי Vanneaux (Hôpital סנט לואיס, פריז, צרפת) לקבל את התשומה שלהם במהלך את ההגדרה של השיטה המתוארת כאן.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Médicale רשרש [תכנית הנדסת ביו - DBS20140930777] ומן LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73] אוליבייה Goureau, קריסטל Monville. זה נתמך על ידי NeurATRIS, המחקר translational תשתית (Investissements d'Avenir) עבור biotherapies מדעי המח [ANR-11-INBS-0011], INGESTEM, התשתית הלאומית (Investissements d'Avenir) הנדסה pluripotent ו הבדיל בתאי גזע [ANR-11-INBS-000] כדי קריסטל Monville. כרים בן M'Barek נתמכה על ידי מלגות Stempole דים ו LABEX להחיות [ANR-10-LABX-73]. גזע הוא חלק של המכון Biotherapies מחלות נדירות נתמך על ידי les חדר מרווח וחדיש האגודה הצרפתית Myopathies (AFM)-Téléthon.

כל החומרים האנושי בשימוש פרוטוקול זה שימשו על פי תקנות האיחוד האירופאי. הקו תא ES האדם השתמשו במחקר זה היה נגזר של העובר ייחודי. השניים מי תרם העובר נמסר באופן מלא, נתנו את הסכמתם לקבלת תרומה אנונימית. קו תא קליני-כיתה ES האדם היה נגזר מן העובר הזה, הפקידה, מוסמך, מתועדים כהלכה על ידי רוזאלין תאים (בריטניה). ירכי היו רכש בתנאים סטריליים במהלך ניתוח קיסרי של אמהות חתמו על הסכמה מדעת לתרומה השליה לפי הקווים המנחים של בית החולים (APHP, Hôpital סנט לואיס).
1. הכנת ריאגנטים ומדיה תרבות
<ol><li>
הכנה של המדיום התרבות תאי RPE
	<ol>
<li>כדי להכין המדיום התרבות תאי RPE, להוסיף סרום 4% תחליף (20 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל), 1,000 x מדולל מרקפטואתנול (500 µL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל) ו 1% Eagle′s המינימום חיוני בינוני (מאמ) חומצות אמינו שאינן הכרחיות פתרון (5 מ"ל הסופי נפח של 500 מ ל) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז גבוהות (475 מ עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ ל).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של המדיום תחבורה/שימור
	<ol>
<li>כדי להכין אמצעי תחבורה/שימור, להוסיף 1% של פניצילין-סטרפטומיצין (5 מ"ל עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) CO2-עצמאית בינוני (495 mL עבור אמצעי אחסון הסופי של 500 מ"ל) ולשמור אותו ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspension של האנזים thermolysin
	<ol>
<li>הכנת פתרון מניות של thermolysin<ol>
<li>כדי להכין פתרון מניות של thermolysin, להפשיר את האבקה thermolysin, שהיה מאוחסן ב-20 ° C, בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>הפעילות האנזימטית מתרחשת עשויה להיות משתנה האצווה כדי אצווה, לחשב בהתבסס על האישור של ניתוח סיפק את האבקה thermolysin של אצווה כדי לשמש את הפעילות הזו. לחלק "פעילות Neutral פרוטאז פרוטאז מחושב = ANPC" (המצוין באישור של אנליזה) על ידי 181 (שהוא משקל מולקולרי של טירוזין). התוצאות המתקבלות מקביל הפעילות האנזימטית מתרחשת הכולל של האבקה שסופקו thermolysin (U/מבחנה).</li>
			<li>להכין פתרון מניות ב- 200 U/mL על-ידי הוספת נפח המים המקביל סך הפעילות האנזימטית מתרחשת (U/מבחנה) מחולק 200 (U/mL).</li>
			<li>להמיס את האנזים על-ידי pipetting המים שנוספה למעלה ולמטה. מערבולת הפתרון עבור 30 s ולבדוק האם האבקה לחלוטין הושעה. Pipetting יותר יהיה צורך פירוק מלא.</li>
			<li>Aliquot הפתרון מניות ואחסן אותו ב-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכנת הפתרון עובד של thermolysin הערה: הפתרון thermolysin צריך להיות מוכן ביום של הטיפול החזיר.<ol>
<li>להפשיר את aliquots מלאי של thermolysin-200 U/mL המאוחסנים ב-20 ° C. לדלל את הפתרון מניות 200 ב- x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על מנת לקבל פעילות אנזימטי הסופי של 1 U/mL. להכין 40 מ ל לטיפול תיקוני חזיר 1 – 4.</li>
			<li>לסנן את הפתרון thermolysin דרך מסנן 0.2 µm לכהן להשתמש.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Resuspension של ג'לטין
	<ol>
<li>הכנה של 20% ג'לטין הפתרון של רחוב הערה: 20% ג'לטין הפתרון של רחוב עשוי להיות מוכנים למעלה 1 שבוע לפני השימוש.<ol>
<li>לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 ° C באמבט מים למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 10 גר' ג'לטין עד 40 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.</li>
			<li>להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. מערבולת כל 10 דקות כדי homogenize את הפתרון.</li>
			<li>לאחר הפתרון הוא הומוגני, להוסיף 4 מ"ל של הפתרון הג'לטין 20% ארבע המנות תרבות 6 ס מ. להימנע בועות. להוסיף סרט פרפין פלסטיק כדי להגן על המנות, ולאפשר את הפתרון שבמהלכו ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכנה של 8% ג'לטין פתרון הערה: הפתרון 8% ג'לטין עשוי להיות להכין יום לפני השימוש ומאוחסנים ב 4 º C.<ol>
<li>לחמם את CO2-בינוניים עצמאיים עד 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (עד 1 h). בשפופרת 50 מ ל, להוסיף 4 גר' ג'לטין עד 46 מ"ל של חימם CO2-בינונית עצמאית, מערבולת הפתרון.</li>
			<li>להמיס את הג'לטין 30 – 60 דקות ב 42 º C. להוסיף סרט פרפין פלסטיק להגן על הצינור ולשמור אותו באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C אם הוא רוצה לשמש באותו היום, או לשמור אותם ב 4 ° C אם זה לשימוש מאוחר יותר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin טיפול של קרום מי השפיר אנושי
<ol><li>
שטיפת קרום מי השפיר אנושי
	<ol>
<li>יש ירכי שסופק כמו חתיכות קטנות (כ 30 מ"מ x 30 מ"מ) קבוע לפיגום ניילון, גם כבר ב 4 ° C ב- PBS או קפוא. אם סופק קפוא, להפשיר את הקרומים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30 דקות.</li>
		<li>לשטוף את הממברנות:<ol>
<li>מקום 1 – 4 ממברנות בבקבוק 250 מ ל המכילה 80 מ ל- PBS. השתמש בקבוקים רבים כנדרש.</li>
			<li>לנער את כל בקבוק ב שייקר צלחת במהירות גבוהה למשך 5 דקות ולאחר מכן למחוק את PBS. מוסיפים 80 מ של PBS, אני חוזר.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טיפול Thermolysin
	<ol>
<li>להוסיף 40 מ של הפתרון עובד של thermolysin (1 U/mL) עבור כל בקבוק המכיל את הממברנות (1-4 ממברנות לכל הבקבוקים; עד 3 בקבוקים בכל פעם).</li>
		<li>לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 rpm ולאחר מכן מערבולת אותם 30 ס חזור על 1 x.</li>
		<li>לבטל את הפתרון thermolysin ולהוסיף 80 מ ל- PBS.</li>
		<li>לנער את הבקבוקים עבור 5 דקות ב 450 סל ד. למחוק את PBS ולהוסיף 80 מ ל- PBS. חזור על 3 x.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. קיבוע של קרום מי השפיר אנושי על הוספה תרבות
<ol><li>להשתמש מלקחיים זמן סטרילי (זה יכול להגיע לתחתית הבקבוק) כדי להסיר את ירכי, אחד אחד, ולהעביר כל חזיר לצלחת תרבות 10 ס מ המכיל 10 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>ב- 10 ס מ תרבות תבשיל חדש המכיל 10 מ"ל ל- PBS, מקום אחד בקרום עם הניילון פונה כלפי מטה. ניתוק שני הקליפים ארבע המשמשים כדי לתקן את הממברנה כדי ניילון.</li>
	<li>הכנס את הטבעת קטנים יותר של תרבות הקדמי בין את הניילון הקרום.</li>
	<li>ודא כי הקרום מכסה לחלוטין את הטבעת קטנים יותר. קליפ החלק השני של תרבות הקדמי על גבי הקרום. קרום המרתף של הבשר המעושן פונה מעלה, בתוך תותב תרבות. לנתק את הקליפים שתי האחרונות.</li>
	<li>חותכים, עם מספריים סטרילי, עודף של הקרום החוצה תותב תרבות במידת הצורך. באמצעות מלקחיים, להעביר את הקרום קבוע את תותב תרבות על צלחת 12-ובכן, להוסיף PBS, ולאחסן את הצלחת באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.</li>
	<li>חזור על פעולות אלה (מתוך שלב 3.2-3.5) עם אחרים בקרום.</li>
</ol>4. מפשיר, זריעת תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי
<ol><li>
הפשרתו של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית
	<ol>
<li>הבנק תאי RPE מוקפא-1 מיליון תאים לכל מבחנה קריוגני בחנקן נוזלי. להפשיר כמה בקבוקונים קריוגני כנדרש (תאים 350,000 הם נזרע לכל ממברנה).</li>
		<li>הכן צינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום RPE לכל מבחנה ההקפאה. ברגע מופשר הוא המבחנה, להעביר כל שפופרת התאים. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.</li>
		<li>Homogenize (פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי resuspend תאי RPE המדיום), קח 10 µL של הפתרון תא, להעביר אותו צינור 1.5 מ ל. להוסיף 10 µL של trypan blue. מקום 15 µL של פתרון זה כדורים הספירה, אז לספור את מספר התאים קיימא (לא נצבעים בצבע כחול) תחת מיקרוסקופ עם יעד X 4. חזור על פעולה זו עבור הבקבוקונים אחרים.</li>
		<li>בינתיים, centrifuge הצינורות 15 מ"ל ב x 110 גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend התאים-תאים למ"ל 700,000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זריעה של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית לתוך קרום מי השפיר אנושי
	<ol>
<li>הסר את לוחית 12-ובכן המכיל את הממברנות של החממה.</li>
		<li>מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 500 µL של התליה תא מוכן בשלב 4.1.4 במרכז תותב תרבות. להוסיף 1 מ"ל של מדיום RPE מחוץ הכנסת תרבות (בתוך הבאר). חזור על הממברנות אחרים.</li>
		<li>מקם את הצלחת 12-ובכן המכיל את הקרומים בחממה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. תחזוקה של תרביות תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית על קרום מי השפיר אנושי
<ol><li>לחדש את המדיום 2 x בשבוע, בדרך כלל בימי שני ושישי, ולפחות עד ליום 30 של התרבות.</li>
	<li>האחות המדיום בתוך ומחוץ את תותב תרבות במשך כל וחידוש זה בינונית טרייה (1 מ"ל בחוץ תותב תרבות ו- 500 µL בפנים). מקם את הצלחת בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.</li>
</ol>6. הכנה של התיקון אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת
הערה: החל ביום 30 של התרבות, הרקמה הוא מוכן השתלת.
<ol><li>חם הפתרון 8% ג'לטין באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות למלא התא הפנימי של. vibratome עם CO קר2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C).</li>
	<li>
למקם את הבלוק הג'לטין 20% vibratome.
	<ol>
<li>קח את הצלחת תרבות 6 ס מ המכיל את הבלוק של 20% ג'לטין מהמקרר. באמצעות אזמל, לגזור בלוק 5 ס מ x 5 ס מ. הדבק את הצד העליון של גוש לתמיכת עם דבק מגע, דבק או למקבילה שלה.</li>
		<li>מקום להב חדש vibratome.</li>
		<li>להתאים את רמת הרחוב עד שהיא באותה רמה של הלהב גילוח.</li>
		<li>למלא את האמבטיה סביב התמיכה CO טריים2-בינוני עצמאית ב 4 º C. חותכים את גוש עם vibratome באמצעות במהירות בינונית עד לבלוק חותכים בצורה אחידה, המוביל משטח חלק. להגדיר את המיקום 0.</li>
		<li>האחות המדיום מסביב לבלוק של ג'לטין עד שהכל יבש לחלוטין, ולאחר מכן לקחת את הצלחת. ובכן 12 תרבות המכיל הרקמות מן החממה ב 37 º C.</li>
		<li>בזהירות באמצעות מלקחיים, פתח את תותב תרבות מעל הרחוב ג'לטין. חותכים, עם המספריים, כל חלקי ממברנות שאינן מכילות תאים (מחוץ לזירה שבה התאים היו לא תרבותי). האחות המדיום שיורית כולו.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של הפתרון 8% ג'לטין נוזלי ב 37 ° C על מנת לכסות את הקרומים. הסר בזהירות את העודפים. המתן 5-8 דקות כדי לאפשר הג'לטין לגבש.</li>
		<li>להוסיף CO טריים2-בינוני עצמאית (ב 4 ° C) לאמבטיה עד מכוסה הקרום.</li>
		<li>חותכים, עם vibratome במיקום של-100 מיקרומטר, עם מהירות בינונית, שנותרו על אופן הפעולה של הרחוב. בסוף המקטע, יש להקפיד לשמור על הכיוון של הרקמה.</li>
		<li>עם איזמל, לחתוך פינה כדי לזהות את הכיוון של המקטע.</li>
		<li>לאסוף את הקרום נעוץ ג'לטין עם מרית ולמקם אותו בצלחת 6-ובכן מלא עם המדיום שימור ב 4 מעלות צלזיוס, עד הרכבה זה לתוך העין הנמען.</li>
		<li>בזמנו של השתלת, להתאים את גודל השתל בהתאם לגודל העין הנמען תחת מיקרוסקופ כירורגי (3-1 על חולדות, 10 – 15 מ מ2 קופים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17101537">Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts.</a> Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).</li>
<li>Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+multifactorial+late-onset+disease%3A+from+genetic+susceptibility+to+disease+mechanisms+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).</li>
<li>Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+pluripotent+stem+cells+to+study+and+treat+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).</li>
<li>Ben M'Barek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+retinal+epithelial+cell+sheets+potentiate+rescue+of+photoreceptor+cell+loss+in+rats+with+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration.</a> Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+Follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cell+monolayers+have+higher+resistance+to+oxidative+stress-induced+cell+death+than+nonpolarized+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).</li>
<li>Diniz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Thomas, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+functionality+of+hESC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+cultured+as+a+monolayer+on+polymer+substrates+transplanted+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).</li>
<li>Borooah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+treat+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).</li>
<li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Making+stem+cells+retinal%3A+Methods+for+deriving+retinal+pigment+epithelium+and+implications+for+patients+with+ocular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Lustremant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+tool+to+model+a+form+of+Leber+congenital+amaurosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis.</a> Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+Cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule-directed%2C+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+stem+cells+grown+into+polarized+RPE+monolayers+on+a+polyester+matrix+are+maintained+after+grafting+into+rabbit+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Ilmarinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+polyimide+membrane+as+cell+carrier+for+subretinal+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell+derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium.</a> PloS One. 10 (11), e0143669(2015).</li>
<li>Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Descemet%27s+membrane+as+membranous+support+in+RPE%2FIPE+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation.</a> Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).</li>
<li>Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968(2012).</li>
<li>Capeans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membrane+as+support+for+human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).</li>
<li>Ohno-Matsui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+amniotic+membrane+on+retinal+pigment+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation.</a> Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).</li>
<li>Paolin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+membranes+in+ophthalmology%3A+long+term+data+on+transplantation+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li>
<li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+therapies+in+combination+with+substrate+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%3A+The+Official+Journal+of+the+Association%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).</li>
<li>Song, M. J., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+into+the+future%3A+Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+build+two+and+three+dimensional+ocular+tissue+for+cell+therapy+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling.</a> Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).</li>
<li>Ramsden, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+Past%2C+present+and+future%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future).</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced%2C+dry+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
</ol>

אוליבייה Goureau הוא הממציא על ממתינים פטנטים הקשורים הדור של תאים ברשתית מתאי גזע pluripotent אנושי. המחברים האחרים אין לחשוף.

אנחנו תיאר שיטה התרבות של תאי RPE וביום לפיגום הביולוגי שלה לקראת ההשתלה במודלים של בעלי חיים. אחד השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הוא שמירה על הכיוון של הבשר לאורך כל ההליך עד ההכללה שלו לתוך הג'לטין. אכן, האפיתל מקורית של הקרום יוסר ולא קרום המרתף שלו הופך להיות חשוף9. תאי RPE חייב להיות נזרע על גבי קרום המרתף הזה. על הכנה להטבעת ג'לטין, חשוב לעבוד עם כל המוצרים בטמפרטורה מוגדרת. אכן, ג'לטין יש את המאפיין להיות נוקשה 4 ° C, נוזלי גוף טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס)9. אם הטמפרטורה...

RPE חיונית הישרדות, הומאוסטזיס של photoreceptors אליו היא משויכת באופן הדוק1. מספר מצבים פתולוגיים לשנות פונקציונליות שלה ו/או הישרדות, כולל RP ו- AMD.
RP היא קבוצה של מוטציות monogenic בירושה המשפיעות על הפונקציות של photoreceptors או תאי RPE או שני2,3. ההערכה היא כי מוטציות המשפיעות באופן ספציפי את RPE תאים חשבון עבור 5% של RP2. AMD היא תנאי אחר שבו השכבה RPE היא שונה, אובדן ראייה בסופו של דבר מרכזי מוביל. AMD נגרמת על ידי פעולת הגומלין המורכבים בין גורמים גנטיים וסביבתיים, ומשפיעה על קשישים4,5,6. על פי התחזיות, AMD יהיה נוגע 196 מיליון חולים ברחבי העולם על ידי 20207. בהפרעות אלה, אין תרופה יעילה קיימת, באחת האסטרטגיות הציע השתלת תאי RPE חדשים כדי לפצות על המלח/מתפקד שישנו RPE תאים8.
המצב של ניסוח של המוצר הסופי כדי להיות הושתל חיונית כדי להבטיח את התוצאה הטובה ביותר תפקודית. תאי RPE להזריק לפי השעיה תא, למרות היותו שיטה קלה וישירה של משלוח, להעלות חששות לגבי שלהם הישרדות, אינטגרציה, פונקציונליות9,10,11,12 , 13. מדענים מפתחים יותר כעת ניסוחים מורכבים כדי לספק מהונדסים רקמת רשתית9,13,14,15,16. בהקשר זה, פיתחנו שיטה מקורית ליצירת במבחנה רקמות RPE שיכול לשמש עבור השתלת9.
בנקים תאי RPE שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים (ES) נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חלופה RPE תא בנקים ממקורות שונים תא (תאי גזע pluripotent הנוצרות על-ידי האדם, תאי RPE העיקרי, וכו ') ו הבדיל בשיטה שונה מתאימים גם עבור פרוטוקול זה. היא כוללת התמיינות מכוונת פרוטוקולים בעזרת ציטוקינים ו/או מולקולות קטנות17,18,19,20,21,22.
כדי להיות מושתלים, להכין את רקמות מהונדסים על גרדום. בשנים האחרונות, פיגומים שונים פותחו בהתבסס על פולימר או על מטריצה של מקור ביולוגי13,23,24. כאן, המצע הביולוגי משמש החזיר, אבל מצעים אחרים, כמו ממברנות ברוך חשופה, ניתן ליישום. השיטה המתוארת במסמך זה יש את היתרון של שימוש לפיגום הביולוגי שהוא רלוונטי יותר לסביבה הטבעית RPE.
ES האדם הנגזרות תא תאי RPE מתורבתים לפחות 4 שבועות על מנת להיות מאורגן באופן מלא כמו טפט המרוצף. בשלב זה, האפיתל שהושג הוא פונקציונלי, מקוטב9. לבסוף, ככל רקמה זו מתקמט בקלות, זה מוטבע בשכבה דקה של נשאית הידרוג לתת לזה עוד קשיחות ואלסטיות וכדי להגן עליו במהלך ההליך הזרקה. מוצר זה מאוחסן אז ב 4 ° C עד הרכבה.

<table><tbody><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית סטרילי</td><td>TechGen International</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>מערכת פינוי פסולת נוזלית לשאיפה</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO2 נשלט +37&nbsp; &deg; חממת תאי C</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&nbsp; ומיקרו; פיפטה L: P200</td><td>גילסון</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; פיפטה מ"ל: P1000</td><td>גילסון</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>פיפט עזר</td><td>דראמונד</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>+4&nbsp; &deg; C מקרר</td><td>Liebherr</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (x2)</td> <td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>מענק subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>איזון דיוק</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>שייקר נדנדה אופקי</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>סרט פרפין מפלסטיק</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 ומיקרו; m מסנן מזרק חד פעמי</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>מזרק ללא מחט 50 מ"ל</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקים 250 מ"ל</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות בז סטריליים</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות בז סטריליים</td><td>Dutscher Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>להכניס</td><td>C00001N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; מ"מ תרבית תאים: B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>12 באר צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות</td> סכיני גילוח <td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>קסטורמה</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (500&nbsp; mL)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysine</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol (50&nbsp; mM)</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>CO2 מדיום בלתי תלוי</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>קרום מי שפיר אנושי</td><td>בנק רקמות בית החולים סנט לואיס (פריז, צרפת)</td><td>לא ישים</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

מספר מצבים פתולוגיים של העין משפיע על הפונקציונליות ו/או ההישרדות של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE). אלה כוללים כמה צורות של רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). טיפול בתאי הוא אחד אסטרטגיות טיפוליות המבטיחים ביותר המוצע כדי לרפא מחלות אלו, עם עידוד כבר תוצאות ראשוניות בבני אדם. עם זאת, שיטת ההכנה של השתל יש השפעה משמעותית על תוצאות תפקודי שלה בתוך vivo. אכן, תאי RPE הושתל כמו השעיה תא מתפקדים פחות מאשר אותם התאים המושתלים כמו רקמת רשתית. במסמך זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור מהנדס RPE רקמות, שלה לקראת ההשתלה ויוו . תאי RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent האנושי הם נזרע על תמיכה ביולוגית, קרום מי השפיר אנושי (חזיר). לעומת פיגומים מלאכותי, תמיכה זו יש את היתרון של בעל קרום המרתף קרוב הממברנה של ברוך שבו תאי RPE אנדוגני מצורפות. עם זאת, מניפולציה שלה אינה קלה, פיתחנו מספר אסטרטגיות שלה culturing הנכונה והכנה הרכבה בתוך vivo.

ירכי מכילים שכבת האפיתל יש להסיר לפני זריעת תאי RPE. טיפול אנזימטי של הקרום מבוצע עם thermolysin תחת רועדת. על מנת לא כדי לא לאבד את הקוטביות של הקרום (האפיתל היא מצד אחד), הוא קבוע על תמיכה הרכב אשר יכול להיות שונה, תלוי הספק (איור 1 א'). בדוק את הידבקות של הקרום לתמיכה שלה בשלב זה ולהוסיף קליפים במידת הצורך. בזמנו של קיבוע תותב תרבות, לעבוד בזהירות כדי להימנע לעשות חורים הקרום ולשמור את הקוטביות שלה עם קרום המרתף פונה כלפי מעלה (איור 1B...

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי טיפול עצמי בעין, כגון מהי היעילות של רקמה מהונדסת ביולוגית שתוכננה במיוחד in vivo. בטכניקה זו אנו מספקים שיטה לייצור ועיצוב רקמת הרשתית וכן אסטרטגיה לעיבוד הרקמה להשתלת עין במודל של בעלי חיים. התחל בשטיפה של 1 עד 4 חתיכות של 30 על 30 מ"מ של קרום מי שפיר אנושי, או hAM.תקן פיגומי ניילון פעמיים ב-80 מ"ל PBS לכל שטיפה בבקבוק 250 מ"ל על שייקר, במהירות גבוהה למשך חמש דקות. לאחר הכביסה השנייה, הוסיפו 40 מ"ל תמיסת תרמוליזין עובדת לכל בקבוק, ונערו את הבקבוקים פעמיים במשך חמש דקות ב-450 סל"ד, ולאחר מכן 30 שניות של מערבולת. לאחר הסבב השני של הטיפול בתרמוליזין, שטפו את החלקים פעמיים נוספות עם 80 מ"ל PBS לכל כביסה, כפי שהודגם.לאחר מכן, השתמשו במלקחיים סטריליים ארוכים כדי להעביר את ה-hAMs בנפרד, לתוך צלחת תרבית בגודל 10 ס"מ, המכילה 10 מ"ל PBS. לאחר מכן, הניחו קרום אחד כשהניילון פונה כלפי מטה בצלחת תרבית שנייה בגודל 10 ס"מ של PBS, ונתק שניים מארבעת הקליפים המחזיקים את הממברנה לניילון. הכנס את הטבעת הקטנה יותר של תוספת התרבית בין הניילון לממברנה, וודא שהממברנה מכסה את הטבעת הקטנה יותר לחלוטין.מהדקים את החלק השני של תוספת התרבית לחלק העליון של הממברנה כך שממברנת הבסיס של ה-hAM פונה כלפי מעלה בתוספת התרבית ונתק את שני הקליפים האחרונים. לאחר מכן השתמש במספריים סטריליים כדי לקצץ כל קרום מחוץ לתוספת התרבות לפי הצורך. והשתמש במלקחיים כדי להעביר את הממברנה לבאר אחת של צלחת 12 בארות, המכילה PBS לאחסון ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.לפני הזריעה, בקבוקוני קריו חמים המכילים פעם אחת 10 עד תאי RPE השישיים ב-3 מ"ל של מדיום RPE בצינור חרוטי אחד של 15 מ"ל לכל בקבוקון. כאשר התאים הופשרו, פיפטה כדי להשיג תרחיפי תאים בודדים בכל אחד מהצינורות, וספרו את מספר התאים הקיימים על ידי אי הכללה כחולה של שלושה פאנים. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בריכוז שבע פעמים 10 עד חמישית תאים למיליליטר במדיום RPE טרי.לאחר מכן, שאפו את ה- PBS מכל באר של צלחת 12 הבארות המוכנה, והוסיפו 500 מיקרו ליטר תאים למרכז כל תוספת תרבות, ו -1 מ"ל מדיום RPE לתחתית כל באר. לאחר מכן החזירו את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 30 יום, והחליפו את המדיום פעמיים בשבוע עד לסיום התרבית. ביום התרבות, 30, יש לחמם תמיסת ג'לטין של 8% באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.וממלאים את החדר הפנימי של ויברטום במדיום עצמאי של ארבע מעלות צלזיוס CO2. השתמש באזמל כדי לחתוך גוש בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ מגוש ג'לטין של 20% המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס. אבטח את הצד העליון של הבלוק לתמיכה בעזרת דבק מתאים.והנח להב חדש לתוך הוויברטום. כוונן את הבלוק עד שהוא יהיה באותה רמה כמו סכין הגילוח, ומלא את האמבטיה סביב התמיכה במדיום עצמאי טרי של ארבע מעלות צלזיוס CO2. חותכים את הבלוק במהירות בינונית עד שהבלוק נחתך באופן אחיד עם משטח מוביל חלק ומגדירים את המיקום לאפס.לאחר מכן שואבים את המדיום סביב הג'לטין עד שהג'לטין יבש לחלוטין. והשתמש במלקחיים כדי לפתוח בזהירות תוספת תרבית זרעי RPE על גבי הבלוק. השתמש במספריים כדי להסיר את כל הממברנה מחוץ לטבעת ההכנסה, ולשאוף את כל נפח המדיום השיורי.הוסף עד 1 מ"ל של תמיסת ג'לטין נוזלית 8% לקרום עד לכיסוי. והסר בזהירות את כל עודפי הג'לטין. לאחר חמש עד שמונה דקות, הוסף מדיום עצמאי טרי של ארבע מעלות צלזיוס CO2 לאמבטיה עד לכיסוי הממברנה המוצקה.ועם הוויברטום במצב 100 מיקרון, חותכים קטע מהקרום במהירות בינונית, תוך הקפדה על כיוון הרקמה. חותכים פינה של הקטע בעזרת אזמל כדי לאפשר זיהוי כיוון הקטע. והשתמש במרית כדי להעביר את הממברנה המוטבעת בג'לטין לאחת משש בארות, מלאה במדיום שימור של ארבע מעלות צלזיוס.כיוון הפרוסה יכול להיות הפוך עקב תנועה משוחררת לפני חיתוך הפינה. לכן הקפידו לאבטח את מיקום הפרוסה מיד לאחר הקטע. לאחר מכן ניתן להתאים את גודל השתל לגודל העין הנמענת תחת מיקרוסקופ כירורגי, לפני השתלה.בדרך כלל נשארים כמה תאים מתים על פני הממברנה, לאחר קיבוע על תוספת התרבית, אך תאים אלה מסולקים כאשר מדיום התרבית משתנה. סיבי קרום הבסיס נראים בהגדלה גבוהה יותר כאשר לא נותרו תאים, מה שמעיד על כך שתקופת הטיפול בתרמוליזין עברה אופטימיזציה. קל יותר לראות את אפיתל הרשתית במיקרוסקופ, כשהוא מתבגר, ויוצר שכבה חד-שכבתית שלמה דמוית אבן לאחר שלושה שבועות.לאחר ארבעה שבועות, האפיתל בוגר מספיק כדי להיות מוכן להשתלה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמצב הג'לטין תלוי בטמפרטורה. לכן הקפידו להקפיד על הטמפרטורות המומלצות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בתאי גזע, לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של רקמה מהונדסת ביולוגית במודל של בעלי חיים של רטיניטיס פיגמנטוזה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו להכנת רקמה על גבי פיגום, לצורך השתלתה לאחר מכן, ניתן ליישם אותה גם על מערכות מורכבות יותר המכילות שכבות קולטני צילום. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הקושי לטפל בקרומי השפיר האנושיים, שהם דקים מאוד ונוטים להתקפל בקלות.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקיבוע קרום מי השפיר האנושי ושלבי הטמעת ג'לטין, קשים ללמידה ודורשים גישת טיפול מסוימת.

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

הזרקת subretinal הוחל נרחב במחקרים פרה של טיפול בתאי גזע חלופי עבור ניוון מקולרי הקשור לגיל. במאמר זה דמיינו, נתאר טכניקה הזרקת subretinal פחות מסוכן, הדירים בדיוק ששונתה באמצעות הגישה הטרנס-scleral להעביר תאים לתוך עיניו חולדה.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

מוצגת כאן טכניקה כירורגית להשתלת רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) בחלל התת-רשתית של מודל בעל חיים גדול.

השתלה תת-רשתית של רקמת רשתית שמקורה בתאי גזע עובריים אנושיים במודל של בעלי חיים גדולים אצל חתולים

כאן מוצג פרוטוקול לבידוד וזיהוי תאי אפיתל ראשוניים של איריס ושל פיגמנט רשתית מיונקים שונים (עכברים, חולדות, ארנב, חזיר וחזירים). השיטה מתאימה באופן אידיאלי לחקר גישות ריפוי גנטי עיניות במגוון סטים עבור ניתוחי ex vivo ובמחקרי vivo הניתנים להעברה לבני אדם.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

פרוטוקול זה מציג גישה טרנס-סקלרלית מונחית ראייה טרנס-אישונים להעברה בטוחה ומדויקת של שתלים תאיים תת-רשתית, עם שיעור נמוך של סיבוכים כירורגיים, במושתלי עכבר עם או בלי ניוון רשתית.

השתלה טרנס-סקלרלית מונחית אישונים של שתלים תת-רשתית במודל עכבר ניוון רשתית

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

למדו שיטה להנדסת רקמות רשתית מ-RPE נגזר מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ממברנות שפיר אמניות. הטכניקה מאפשרת הכנת רקמה לשתל בעין ומספקת בסיס למחקר טיפולים רטינליים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

גלה סרטונים נוספים