Name: 종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 학습하세요 종양 용해성 바이러스 벡터 설계 및 평가 방법을 통해 암 면역치료를 위한 표적 면역조절을 수행하는 기술입니다. 이 프로토콜은 역유전학 시스템을 활용하여 다양한 연구 목적에 적응 가능한 벡터 개발을 가능하게 합니다.

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이러한 메서드는 하이델베르크에서 종양 질환에 대 한 국립 센터에서 교수 박사 닥터 가 Ungerechts에 의해 주도 Virotherapy 그룹에서 설립 되었다. 우리는 그와 특히 박사 토 비아 스 스펙, 박사 Rūta Veinalde, 주 디스 포스터, Birgit Hoyler, 그리고 제시카 알 버트 실험실 팀의 모든 구성원에 게 빚을. 이 작업으로는 다른 Kröner-Fresenius-재단 지원 (서 기 Engeland에 그랜트 2015_A78)와 독일 국립 과학 재단 (DFG, EN 1119/2-1 기 Engeland 부여). J.P.W. Heidbuechel 암 연구에 대 한 헬름홀츠 국제 대학원에 의해 봉급을 받습니다.

서 기 Engeland 암 Immunovirotherapy 하이델베르크 대학에 의해 소유에 대 한 특허에 관한 RNA 바이러스의 공동 발명자로 나열 됩니다. J.P.W. Heidbuechel 공개 상관이 있다.

Oncolytic immunotherapy (즉,., 함께 immunomodulation OVT) 암 치료, 개발 및 최적화 인코딩 immunomodulatory 단백질 oncolytic 바이러스의 추가 요구에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다. 이 프로토콜에는 생성 하 고 같은 벡터를 관련 전 임상 모델에 새로운 항 암 치료제로 잠재적인 미래 임상 번역 이후 테스트에 대 한 유효성을 검사 하는 방법을 설명 합니다.
뚜렷한 장점 가진 수많은 다른 oncolytic 바이러스 플랫폼63사용할 수 있습니다. 이외에 암 특이성, 벡터 안전, 제조에 대 한 요구 사항, 종양 세포 세포의 용 해, 및 면역 반응의 유도 효능, 용량을 복제 특정 oncolytic를 사용 하 여 immunomodulators의 성공적인 벡터화에 대 한 키입니다. 불행히도, 다른 OVs의 직접 비교는 현재 부족 한 하 고 개별 환자에 대 한 최적의 치료...

Oncolytic 바이러스 (OVs) 특별히 내에서 복제 하 고 건강 한 조직을 그대로 하면서 종양 세포를 죽 일 항 암 치료제로 개발 되 고 있다. 그것은 지금 이해 하는 oncolytic virotherapy (OVT), 대부분의 경우에서 공통 되고있다, 효율적인 복제 및 바이러스의 확산에 의해 완전 한 종양 세포에 전적으로 의존 하지 않는 하지만 치료 성공에 대 한 행동의 추가 메커니즘을 필요로 포함 혈관 및 실질 대상 및, 중요 한 것은, 면역 자극1,2,,34. 현재 연구는 이해 하 고, 잠재적으로 소설 OVs, 그리고 유전 공학 고급 오븐을 만들기 위해 제공 하는 가능성을 포함 하는 바이러스 바이오 뱅크 개선된 생물에서 이익이 되었다 많은 초기 OV 연구 수정 되지 않은 바이러스를 사용 하는 동안 플랫폼5,,67.
OVs. 의 유전 공학에 관한 특별 한 관심의 immunomodulatory transgenes는 immunotherapy의 최근 성공을 감안할 때, OV 감염 된 종양 세포에 의해 같은 유전자 제품의 타겟된 식 조직 관리에 비해 독성을 감소 시킨다. 타겟팅 고유의 oncoselectivity 바이러스를 사용 하 여 또는 바이러스 성 차 있는 굴곡 운동8수정 하 여 이루어집니다. 로컬 immunomodulation OVT의 다각적인 안티 종양 메커니즘을 향상 시킵니다. 또한,이 전략은 심문 바이러스, 종양 세포 및 숙주 면역 체계 사이 상호 작용에. 이 위해이 프로토콜 설계, 복제, 구출, 전파, 및 oncolytic 바이러스인 (특히 홍 역 바이러스) 벡터 같은 transgenes 인코딩 유효성을 검사 하는 적용 및 조정 가능한 워크플로우를 제공 합니다.
변조 면역 반응의 다양 한 암 면역 주기9, 종양 항 원 인식 [예, 종양 관련 항 원 (다시) 또는 inducers의 강화 등의 다른 단계를 대상으로 하는 transgene 제품에 의해 달성 될 수 있다 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자] 효율적인 항 원 프레 젠 테이 션 (cytokines);에 대 한 수지상 세포 성숙 지원 통해 보충 하 고와 같은 원하는 면역 세포를 활성화 세포 독성 그리고 헬퍼 T 세포 [발산, bispecific T 셀 engagers (BTEs)]; 규정 하는 T 세포, 억압 파생 골수성 세포, 종양 관련 된 대 식 세포 등 암 관련 된 섬유 아 세포 (항 체, BTEs, cytokines); 진압 세포를 대상으로 이펙터 세포 억제와 피로 (검사점 억제제)을 방지 하 고. 따라서, 생물 학적 에이전트의 과다 제공 됩니다. 각 메커니즘의 이해 뿐만 아니라 치료 효능과 가능한 시너지 효과 관한 이러한 바이러스 인코딩된 immunomodulators의 평가 암 치료를 개선 하는 데 필요한.
Paramyxoviridae 가족의 부정적인 감각 단일 가닥 RNA 바이러스 oncolytic 벡터로 그들의 사용에 도움이 되는 몇 가지 기능이 특징입니다. 이러한 자연 oncotropism, transgenes (5 kb 이상)10,11, 확산 syncytia 형성 및 높은 immunogenicity12를 포함 하 여 효율적인 대용량 게놈을 포함 됩니다. 따라서, OV 플랫폼에 따라 개 디 스템 퍼 바이러스13, 유행 성 이하선염 바이러스14, 뉴캐슬 질병 바이러스15, 센다이 바이러스16,17, 유인원 바이러스 518, Tupaia 바이러스인19 개발 되었습니다. 가장 눈에 띄게, 긴장 (MV) 전 임상 및 임상 개발20,21에서 진행 하는 감쇠 홍 역 바이러스 백신 라이브. 이러한 바이러스 변종 우수한 안전 기록22와 일상적인 예방 접종에 대 한 수십 년 동안 사용 되었습니다. 또한, paramyxoviruses의 엄격 하 게 cytosolic 복제로 인해 insertional mutagenesis에 대 한 위험이 있다. 다재 다능 한 반전 유전학 시스템 추가 전사 단위 (ATUs)로 transgenes의 삽입을 허용 하는 안티 게놈 cDNA에 따라 사용할 수 있는11,,2324입니다. MV 벡터 바이러스 성 유전자 발현에 대 한 대리 표식으로 나트륨 요오드 화물 symporter (MV-NIS) 이미징 및 방사선 치료 또는 녹는 carcinoembryonic 항 원 (CEA MV)에 대 한 인코딩 (NCT02962167, NCT02068794, 임상 시험에서 평가 되 고 현재 NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590, 및 NCT00408590). 안전 관리를 확인 하 고 항 종양 효과의 경우 이전 연구25,26,,2728,29, 에서 보고 되었습니다 30 (Msaouel et al.31검토), 개발 및 preclinically 테스트 추가 oncolytic 홍 역 바이러스에 대 한 방법을 포장. 분자 암 면역 주기의 다양 한 단계를 대상으로 종양의 성장을 지연 및 면역 중재 효능 및 장기 보호 면역 메모리 syngeneic에 증거와 쥐, 생존을 연장 표시 되었습니다 immunomodulatory 인코딩 MV 마우스 모델입니다. 벡터 인코딩된 transgenes granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)32,33, 헬리코박터 neutrophil 활성화 단백질34, 검사점 면역 억제제35를 포함 인터 루 킨-12 (IL-12)36,37, 다시 및 BTEs38, CD3와 종양 표면 항 원 상호 링크 따라서 polyclonal T 세포, T 세포 수용 체 특이성 및 공동 자극 (에 관계 없이 안티 종양 활동을 유도 그림 1)입니다. 유망한 임상 결과 얻은 이러한 구문에 대 한 수요가 더 변환 노력.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), 형식이 나 인코딩 GM-CSF, 포진 심 플렉스 바이러스는 미국 식품 의약품 안전 청 (FDA) 및 유럽 의약품 청 (EMA)에 의해 승인 된 유일한 oncolytic 치료. 늦은 2015 년에 승인으로 이어지는 단계 III 연구는만 고급 흑색 종39종양 내 주입, 아니라 abscopal 효과 (즉, 병 변 비 주입의 remissions)의 사이트에서 효능을 표시 하지는. T-VEC 다른 종양 엔터티 (예: NCT03458117,, 비 흑색 종 피부 암, 췌장암, NCT03086642)에서 응용 프로그램 및 면역 검사점으로 특히 조합 치료의 평가 대 한 추가 재판 이후 들어갔습니다. 억제제 (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297, 및 스 et al.40).
이것는 oncolytic immunotherapy의 잠재력 뿐만 아니라 OVT immunomodulation의 뛰어난 조합을 식별 하는 추가 연구에 대 한 필요성을 보여줍니다. 합리적인 디자인 추가 벡터 및 전 임상 시험에 대 한 그들의 개발의이 사업에 열쇠 이다. 이 또한 기본 메커니즘의 이해를 사전 그리고 더 맞춤된 암 치료 쪽으로 진행에 대 한 의미를 갖는다. 이 위해,이 게시 수정 및 표적된 암 immunotherapy에 대 한 paramyxoviruses의, 더 구체적으로, T 세포-매력적인 항 체 (그림 2) 인코딩 oncolytic 홍 역 바이러스의 개발에 대 한 방법론을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>래피드 DNA 데포스 & 결찰 키트</td><td>Roche Life Science, 만하임, 독일</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET PCR 클로닝 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Germany</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Competent E. coli</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB medium after Lennox</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Germany</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme HindIII-HF</td><td>New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Germany</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Biosera, Boussens, France</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, Mannheim, Germany</td><td>E2311</td><td>은 선택의 transfection 시약으로 대체될 수 있습니다</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>ATCC, Manassas, VA, USA</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td><td></td><td>요청 시 사용 가능</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, Braunschweig, Germany</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (무혈청 배지)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>색 셀 Viability Kit III (XTT)</td><td>PromoKine, Heidelberg, Germany</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>includes XTT reagent</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Ni-NTA Spin Columns</td><td>QIAGEN, Hilden, Germany</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, 독일</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&nbsp; kDa</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Merck Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG 인간 혈청</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-092-257</td><td>RRID:</td></tr><tr><td>AB_871939 Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 항체</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>12158167001</td><td>RRID: AB_390915</td></tr><tr><td>Anti-Biotin MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA</td><td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay</td><td>Promega, Mannheim, Germany</td><td>G1780</td><td>10x 용해 용액, 기질 용액(기질 혼합 및 분석 완충액) 및 정지 용액 포함</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning, Reynosa, Mexico</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>10cm 접시</td><td>Corning, Oneonta, NY, USA</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15cm 접시</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, U-bottom</td><td>TPP, Trasadingen, Switzerland</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트, 평평한 바닥</td><td>Neolab, 하이델베르크, 독일</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Neolab, 하이델베르크, 독일</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Neolab, 하이델베르크, 독일</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>T175 세포 배양 플라스크</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m filters</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

종양 대상 immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

성공적인 암 immunotherapy 장기 종양 제어 달성 가능성이 있다. 최근 임상 성공에도 불구 하 고 개별 종양 면역 프로 파일에 맞게 안전 하 고 효과적인 치료를 위한 긴급 한 필요가 남아 있습니다. Oncolytic 바이러스는 항 종양 면역 반응으로 종양 제한 유전자 발현 유도 사용합니다. 이 프로토콜의 immunomodulatory oncolytic 벡터 생성 및 전 비보 분석을 설명합니다. 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 백신 바이러스에 초점을 맞추고, 일반적인 방법 다른 바이러스 종 및 transgenes 적응 될 수 있다. 제시 워크플로 디자인, 클로닝, 구조, 및 재조합 형 바이러스의 전파를 포함 되어 있습니다. 복제 속도 론 및 벡터의 용균성 활동 ex vivo 격리 된 immunomodulator의 기능을 분석 하는 분석 되어, 전 임상 모델에서 추가 개발을 위한 새로운의 생성을 촉진 하 고 궁극적으로 임상 번역입니다.

그림 1 에서는 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 oncolytic 홍 역 바이러스의 행동의 메커니즘을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 워크플로 묘사 하는 순서도 그림 2에 표시 됩니다. 그림 3 수정된 oncolytic 홍 역 바이러스 게놈의 예가 나와 있습니다. 이 삽입된 transgenes의 홍 역 바이러스 방지 게놈과 특정 기능에 적용 되는 특정 변경의 시각적 표현을 제공 합니다. 전형적인 홍 역 바이러스 유도 syncytia 그림 4에 묘사 된다. 실험을 반복 하는 경우 참고 높은 세포 밀도 나타내는 구조 (A, B), 수확의 timepoint에 셀 수를 줄일 수 있습니다. 부 화 온도 및-번 뿌리...

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

이 방법은 표적 면역 변조를 위한 종양용액 벡터의 발달을 촉진하여 암 면역 요법 분야의 주요 과제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 적용된 역유전 시스템의 주요 장점은 다재다능함입니다.따라서 벡터는 다양한 연구 질문을 해결하고 다양한 면역 서명을 가진 종양을 대상으로 조정할 수 있습니다. 특히 바이러스를 수확하는 최적의 시점을 결정하는 바이러스 전파 단계는 시간이 지남에 따라 시각적으로 동기화증 형성을 평가해야 하기 때문에 텍스트 프로토콜에서 배우기 어렵다.원고에 설명된 바와 같이 재조합 면역 조절 벡터를 설계 및 복제하기 시작한다. 이 프로토콜은 이중특이적 T 세포 종사자를 코딩하는 온코리틱 홍역 백신 벡터의 개발을 위한 특정 단계를 설명합니다. cDNA에서 홍역 바이러스를 구출하기 위해, 24 시간 전에 홍역 플레이트 홍역 바이러스 생산자 세포는 6 벽판에 균등하게.종자 200, 000 세포 2 밀리리터 DMEM에 있는 10% FBS를 포함하는 것은 전형시 65 75% 합류를 달성하기 위하여 우물 당 10% FBS를. 세포를 변형시키는 데 사용될 홍역 바이러스 항유놈을 인코딩하는 재조합 DNA 5 마이크로그램을 혼합합니다. DMEM의 총 200 마이크로 리터의 적절한 플라스미드와 형광 기자.18.6 마이크로리터의 리포소피 트랜스펙트 시약을 혼합물에 넣고 튜브를 즉시 플릭하여 혼합합니다. 실온에서 25분 동안 이 형질 혼합물을 배양합니다. MV 생산자 세포는 65~75%의 컨플루엔티시로 자라난 6개의 웰 플레이트에서 배지를 제거하고 2% FBS와 50 마이크로그램당 DMEM의 1.8 밀리리터를 잘 포함한다.그런 다음 각 우물에 드롭 와이즈를 드롭 스페션 믹스를 추가하고 조심스럽게 소용돌이. 하룻밤 사이에 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 다음 날 배지를 2밀리리터의 신선한 DMEM으로 교체하고 밀리리터 카나마이신당 50마이크로그램을 사용하면 중간체가 황색으로 인식되면 이를 반복합니다.현미경을 사용하여 기자 유전자 발현 및 syncytia 형성을 위해 매일 세포를 관찰한다. 20개 이상의 세포로 구성된 큰 싱크로티아가 보이거나 세포가 너무 조밀해질 때 바이러스를 수확한다. 예상 수확 종자 전에 24 시간 약 150 만 MV 생산자 세포 DMEM의 12 밀리 리터와 10 센티미터 요리에 10 % FBS와 함께 바이러스 접종 시 65 ~75 %의 합류를 달성.바이러스 를 수집하기 위해 세포

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

분리된 면역 조절제의 면역학적 기능을 평가합니다. 다음은 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석법을 통해 이중 특이성 T세포 인게이저(BTE)에 의해 유도된 세포 매개 세포독성을 평가하는 상세 방법을 설명합니다. 실험 중에 테스트할 조건을 결정하십시오(그림 1 참조). 시간대(시간에서 일 단위), 면역 조절제의 농도(pg/mL에서 µg/mL), 그리고 작동 세포 대비 표적 세포(E:T) 비율(예: 1:50에서 50:1 사이)을 다양하게 설정할 수 있습니다. 샘플은 항상 3반복으로 준비하십시오. BTE 단백질과 작동 세포가 없는 샘플, 단일 세포 유형(Tsp 및 Esp)의 자발적 LDH 방출 대조군, 판독 전 계면활성제를 첨가한 표적 세포 최대 용해 대조군(Tmax), 배지만 포함된 대조군, 그리고 Tmax를 위한 부피 대조군을 포함하십시오. 참고: 필요한 표적 세포 수와 배양 시간은 다를 수 있습니다. 최적의 파라미터를 식별하기 위해 작동 세포와 면역 조절제 없이 초기 테스트 런을...

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